本文作者：张琪，李健（北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所 消化肿瘤内科 恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室，北京 100142）
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【摘要】 免疫治疗为结直肠癌患者提供了新的选择，但目前明确的获益人群仅局限于微卫星高度不稳定（microsatellite instability-high，MSI-H）患者，且在此类患者中仍然存在疗效差异。高肿瘤突变负荷和DNA聚合酶亚基的关键编码基因POLE/POLD1突变是除MSI-H外最具潜力的免疫治疗预测指标。结直肠癌中程序性死亡蛋白配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）表达与否与免疫治疗疗效并无明确关联。其他如肿瘤新抗原、肠道菌群等生物标志物也在研究中。结合结直肠癌异质性，联合多种生物标志物进行预测或许更具前景。
【关键词】 结直肠癌；免疫治疗；预测标志物
免疫治疗，尤其是免疫检查点抑制剂（immunotherapy checkpoint inhibitor，ICI）为晚期结直肠癌患者带来了希望，但早期研究显示免疫治疗在非选择性结直肠癌中效果非常有限[1,2]。尽管后续逐渐发现了微卫星状态和肿瘤突变负荷（tumor mutation burden，TMB）等预测指标，但真正能获益的患者仍然有限。考虑免疫治疗昂贵的费用和导致的不良反应，探索预测免疫治疗效果的标志物并充分利用至关重要。
1 微卫星状态
既往研究证实，微卫星状态是包括结直肠癌在内的泛瘤种免疫治疗效果的预测指标[3]。微卫星高度不稳定（microsatellite instability-high，MSI-H）/错配修复功能缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）结直肠癌通常有较高的新抗原负荷[4]，丰富的淋巴结细胞浸润[5]以及肿瘤微环境中如程序性死亡蛋白-1（programmed death-1，PD-1）、程序性死亡蛋白配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4，CTLA-4）上调[6]，可能是免疫治疗有效的原因。但在MSI-H/dMMR结直肠癌中，抗PD-1单药治疗效果也存在较大差异[客观有效率（objective response rate，ORR）为28%～52%，疾病控制率（disease control rate，DCR）为51%～82%][3,7]。2020年美国临床肿瘤学会胃肠肿瘤研讨会（American Society of Clinical Oncology-gastrointestinal cancer，ASCO-GI）公布了CheckMate-142研究使用纳武利尤单抗联合伊匹单抗的最新数据：双免疫治疗MSI-H/dMMR结直肠癌的ORR为64%。说明MSI-H/dMMR单独作为免疫疗效预测指标仍未满足临床需求。
通过免疫组化和聚合酶链反应评估肿瘤组织样本的微卫星状态已较为成熟。随着基因检测技术的发展，二代基因测序（next generation sequencing，NGS）也开始应用于微卫星状态检测，并有较高的灵敏度和一致率[8,9]。同时进行微卫星状态和RAS、RAF等靶向基因检测可以大大减少组织样本需求。通过NGS检测外周血循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）的MSI（MSI from blood ctDNA，bMSI）也进入临床验证阶段[10]，这为晚期肿瘤患者标本取材困难或不足提供了新的解决办法，并且显示出较好的前景。北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科沈琳教授牵头的bMSI在以消化系统为主的多中心临床疗效验证队列研究（IMPACT研究）已进入数据分析阶段，结果值得期待。
2 肿瘤突变负荷
TMB已在多个实体瘤中被证实是独立于MSI状态和PD-L1表达的ICI疗效预测指标[11-13]。目前认为TMB越高，肿瘤免疫原性越强，肿瘤细胞被T细胞识别的概率越大，使用ICI更易引起免疫应答。在结直肠癌中，dMMR肿瘤TMB显著高于错配修复功能完整（proficient mismatch repair，pMMR）肿瘤[11]。
由于TMB与MSI存在密切关系，因此，TMB能否作为结直肠癌独立的疗效预测指标目前仍有争议，且其高低分界阈值尚无定论。一项纳入22例经免疫治疗的MSI-H的转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）患者的研究显示，TMB与ORR和无进展生存（progression free survival，PFS）时间密切相关，高TMB患者（TMB＞41个突变/Mb）疾病均得到控制，且截至数据发表时，患者的中位PFS尚未达到（中位随访时间超过18个月），低TMB者（TMB＜37个突变/Mb）DCR仅为33.3%、中位PFS时间仅2个月[7]。CheckMate-142研究显示，双免疫治疗MSI-H的mCRC患者ORR更高，表明双免疫治疗对TMB的阈值要求或许更低[14]。2019 ASCO-GI公布的CCTG CO.26研究中使用度伐利尤单抗＋抗CTLA-4双免疫治疗微卫星稳定型（microsatellite stability，MSS）结直肠癌亚组分析发现：高TMB患者（TMB＞28个突变/Mb）双免疫治疗明显获益[中位总生存（overall survival，OS）时间：双免疫治疗组5.5个月∶最佳支持治疗组3.0个月，P＝0.004][15]，这也进一步说明了TMB可能是独立于微卫星状态的ICI疗效预测指标。
目前TMB的测量方法有两种，一种是全外显子组或全基因组测序对肿瘤基因组中编码区发生的非同义突变的数量进行定量，是目前TMB检测的"金标准"；另一种是通过目标靶向测序，根据特定算法计算出TMB。一项包含18 140例结直肠癌患者的队列分析结果显示，MSI-H患者（821例）中位TMB为46.1个突变/Mb，MSS患者为3.5个突变/Mb，建议区分高低TMB的最佳阈值定位为37.4 个突变/Mb，
这与前文所述免疫治疗效果验证的小队列研究结论基本一致[7]，也期待这一大样本经疗效验证后的结果。目前关于TMB的临床应用仍存在问题，如检测技术要求较高、检测平台尚缺乏规范、检测费用昂贵等。
3 POLE/POLD1
DNA聚合酶亚基的关键编码基因POLE和POLD1对于NDA复制的校对和保真发挥重要作用[16]。既往研究显示，POLE和/或POLD1基因突变发生率约为1%，以年轻、男性、右半结肠癌多见，且突变患者预后较好[17]。与MSI-H肿瘤相似，POLE/POLD1突变与高TMB相关[18,19]，POLE突变的结直肠癌CD8+淋巴细胞浸润增加，细胞毒性T细胞标志物和效应细胞因子表达增加，同时编码免疫检查点基因（PD-1、PD-L1、CTLA4）上调[20]。
既往有关POLE和POLD1突变结直肠癌患者免疫治疗有效仅有个案报道[21]。2019年徐瑞华教授团队通过公共数据库检索了47 721例肿瘤患者并进行分析显示：结直肠癌POLE和/或POLD1突变频率为7.37%（197/2674）。在所有接受ICIs治疗的实体瘤患者中，突变患者的OS显著优于野生型患者（34个月∶18个月，P＝0.0038），虽然其中26%的患者合并MSI-H，但去除这部分患者后其生存获益仍十分显著（28个月∶16个月），多因素分析也证实POLE和/或POLD1突变可作为预测ICIs治疗获益的独立指标（P＝0.047）[22]。目前评估POLE突变结直肠癌的ICI研究（NCT03150706，NCT03435107）也正在进行中。
4 程序性死亡蛋白配体-1
肿瘤微环境中PD-L1上调与效应T细胞浸润增加相关，因而认为PD-L1阳性表达的肿瘤患者更可能从ICI治疗中获益。虽然PD-L1表达在胃癌和肺癌等癌种中被认为是免疫治疗的预测指标之一[23]，但目前证据认为其在结直肠癌中并无预测价值。KEYNOTE-028亚组分析中，接受帕博利珠单抗治疗的23例PD-L1阳性结直肠癌患者中仅1例达到部分缓解（partial response，PR）（ORR为4%），且该例患者为MSI-H/dMMR[24]。KEYNOTE-016研究显示，帕博利珠单抗治疗mCRC的PFS和OS与PD-L1表达无关[25]。CheckMate-142研究显示，纳武利尤单抗单药或联合伊匹单抗治疗mCRC，证实其ORR与PD-L1表达无关[14]。PD-L1作为细胞表面蛋白，其表达与否与局部肿瘤微环境内的相互作用有关，呈动态变化，这可能是PD-L1表达状态与抗PD-1/PD-L1治疗效果不一致的原因之一[26]。此外，检测试剂的差异和阳性阈值的界定也可能影响PD-L1表达的预测价值[26]。
5 其他生物标志物
5.1 新抗原负荷 MSI-H和高TMB对免疫治疗有反应的机制均被认为与产生了更多的新抗原相关[27]。新抗原负荷，即由T细胞靶向的肿瘤特异性突变数目，理论上是一项更直接、更强效的预测指标。通常新抗原的计算基于锚定在主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）上的残基肽来预测，但研究证实该方法所得结果并不优于TMB[28]。预测新抗原的其他工具和模型正处于研究阶段，如通过评估突变型和野生型肽产生的MHC结合位点的半抑制浓度差异识别新抗原的抗原表位识别力差异指数（differential agretopicity index，DAI）[29]、包含肿瘤克隆以及DAI和免疫微生物表位的同源序列三种要素的评分矫正模型[30]等。随着基因测序技术的发展和大数据分析能力的提高，尤其对于MSI-H占比较高的结直肠癌，肿瘤新抗原定会成为预测免疫治疗效果的重要标志物之一。
5.2 肠道菌群 肠道菌群对免疫治疗的影响正在如火如荼地研究中。自2018年，研究相继发现，无法从免疫治疗获益的肺癌和肾癌患者体内缺乏Akermansia Muciniphila细菌，并通过粪便移植的小鼠证实了这一菌群对抗PD-1治疗的影响[31]。后续关于黑色素瘤患者免疫治疗的研究进一步证实了肠道菌群对免疫治疗的作用[31,32]。而在结直肠癌演变中发挥基础作用的肠道菌群有望成为预测免疫治疗效果的重要指标[33]。
5.3 肿瘤浸润淋巴细胞 ICI治疗机制是通过增强体内已经存在的免疫反应发挥抗肿瘤作用[34]，因此，肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TILs）被认为是极具潜力的疗效预测标志物。其中，基于肿瘤中心和侵袭边缘中CD3+和CD8+T细胞密度确定的免疫评分，被证实可预测Ⅰ～Ⅲ期结肠癌患者预后[35]，甚至优于TMN分期。免疫评分作为直接反映肿瘤内部免疫状态的指标，也有望成为免疫治疗效果的预测指标，一项在高免疫评分的mCRC患者中评价化疗联合帕博利珠单抗疗效的研究即将开展（POCHI研究）。
5.4 炎性T细胞基因表达谱 T细胞分泌的γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）是PD-L1表达的关键驱动因子。一项研究通过RNA测序筛选出与IFN-γ相关的mRNA，形成由18个基因组成的基因组合，以此对
炎性T细胞基因表达谱（gene expression profile，GEP）进行分析，结果显示T细胞GEP可以作为经帕博利珠单抗治疗且包含结直肠癌在内的9个瘤种的疗效预测指标[36]。后续一项汇总四项KEYNOTE研究（包含结直肠癌共22种、300例样本）也证实了上述结论，且炎性T细胞GEP联合TMB可进一步提升预测价值，其中高TMB、高GEP患者免疫反应最强。该结论得到来自TCGA数据库的6384例样本验证[12]。但研究采用的mRNA检测，目前在国内检测平台比较少见，其费用相对昂贵，应用于临床尚需时日，且该标志物尚需结直肠癌大样本队列进一步验证。
5.5 其他免疫相关指标 编码β2微球蛋白的B2M基因截短突变可以导致MHC-Ⅰ抗原呈递受损，引起免疫逃避，虽然研究表明有B2M突变的MSI-H结直肠癌预后更好[37]，但存在该突变的肿瘤可能对帕博利珠单抗反应较差[3]。一项研究通过对接受帕博利珠单抗治疗的结肠癌和黑色素瘤样本分析显示：JAK1/2基因突变通过导致癌细胞PD-L1表达下调，使免疫治疗耐药[38]。此外，黑色素瘤和非小细胞肺癌中LRP1B基因突变[39]、黑色素瘤中SERPINB3和SERPINB4基因突变[40]、肾细胞癌中PBRM1基因失活突变[41]可能是免疫治疗反应的正向预测指标；而非小细胞肺癌中STK11/LKB1突变、黑色素瘤和子宫平滑肌瘤中PTEN基因失活突变[42,43]是免疫治疗的负向预测指标；但上述指标对结直肠癌的免疫治疗是否有预测作用尚需大样本队列研究验证。
结直肠癌是一类异质性极强的瘤种，单一的生物标志物均难以准确预测免疫治疗效果，联合多种指标，如MSI-H/TMB[7]、TMB/炎性T细胞GEP[12]，抑或纳入多项指标的预测模型更加具有前景。
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