實驗原理
從細胞或組織中得到RNA是一種混合物，其中包括tRNA，rRNA和mRNA，其中RNA為75％～ 85％，tRNA佔10％～16％，而mRNA僅佔1%～5％，並且mRNA基因序列不同，分子量大小不均一，各基因的表達丰度也不一樣。每克細胞可分離出5-10mg RNA。
真核生物mRNA具有5’端帽子結構（m7G）和3’端的poly(A)尾巴。絕大多數哺乳動物細胞的3’端存在20-300個腺苷酸組成的poly（A）尾，這種結構為真核mRNA分子的分離和純化，提供了極為方便的條件，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的實驗理論就在於此。
一般mRNA分離純化的原理就是根據mRNA 3’端含有poly(A)尾巴結構特性設計的。當總RNA流經寡聚（dT）（即oligo(dT)）纖維素柱時，在高鹽緩衝液作用下，mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經過oligo(dT)纖維素柱吸附和解吸附，即可得到較純的mRNA。
實驗材料
1、0.1mol/L NaOH （用0.1% DEPC處理過的無RNase水配置）
2、寡聚Oligo（dT）-纖維素
3、加樣/洗滌緩衝液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。（用0.1% DEPC處理過的無RNase水配置）
4、洗滌緩衝液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。（用0.1% DEPC處理過的無RNase水配置）
5、5 mol/L NaCl（加0.1% DEPC處理過夜）
6、3 mol/L NaAc pH5.2（加0.1% DEPC處理過夜）
7、無RNase雙蒸水(DEPC水)
8、70%乙醇（用0.1% DEPC處理過的無RNase水配置）
需要用到的實驗儀器：恆溫水浴箱，高速冷凍離心機，紫外分光光度計，巴斯德吸管，玻璃棉，5ml一次性注射器。
實驗過程
（一） oligo(dT)纖維素的預處理
1、用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。
2、將懸浮液裝入填有經DEPC水處理，高壓滅菌後的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床約0.5-1.0mL，用3倍柱床體積的無RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。
3、用3-5倍柱床洗滌緩衝液I沖洗oligo(dT)纖維素，直到流出液的pH值小於8.0。
4、將處理好的oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出，用適當的柱床洗滌緩衝液I懸浮，濃度約為0.1g/mL，保存在4℃待用。
（二） 總RNA濃度的調整
1、把總RNA液轉到適合的無RNase離心管中，測定總RNA的濃度。如果總RNA的濃度大於0.55mg/mL，則用無RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL，總RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。濃度調整以後，把RNA溶液置於65℃水浴加熱5 min，然後迅速插在冰上冷卻。
2、加入一定體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調至0.5 mol/L。
（三） mRNA的分離
1、mRNA與Oligo(dT)-纖維素結合：用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素，取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中，蓋上蓋子，顛倒數次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。於37℃水浴保溫並溫和搖盪15min。oligo(dT)-纖維素與RNA所需量如下表。
表1 總RNA量所需材料的體積
總RNA（mg）
oligo(dT)-纖維素（ml）
洗滌緩衝液1,2（ml）
洗脫體積（ml）
<0.2
0.2
1.0
1.0
0.2-0.5
0.5
1.5
1.5
0.5-1.0
1.0
3.0
3.0
1.0-2.0
2.0
5.0
5.0
2、轉移：取1個5ml注射器，用經過高溫滅菌的玻璃棉塞緊注射器前端，注射器固定在無RNase的支架上，把oligo(dT)-纖維素/RNA懸浮液加入注射器中，把塞子推到底部，收集流出的液體，即把含有未結合上的RNA液體收集到無RNase的離心管中（保留至確定獲得足夠的mRNA）。
3、洗滌：根據表1所需洗滌緩衝液1的體積，直接用注射器慢慢吸取，溫和振盪，充分懸浮mRNA-oligo(dT)-纖維素，推動塞子，用無RNase的離心管收集洗出液。測定每一管的OD260，當洗出液中OD值為0時準備洗脫。
4、洗脫：根據表1所需洗脫液體積，用注射器慢慢吸取洗脫緩衝液2或無RNase雙蒸水到注射器內，充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素，推動塞子，以1/3至1/2柱床體積分裝到無RNase的離心管中。
5、測定每一管的OD260，合併含有RNA的洗脫液。在4℃條件下，2500g，離心2-3min，將上清轉移至新無RNase的離心管中。
6、沉澱：向上清液中加入1/10體積的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻後，-20℃條件下沉澱30min或放置過夜。
7、離心收集：4℃條件下，12000g, 離心15min，小心棄去上清，用70%乙醇漂洗沉澱，4℃條件下，12000g, 離心5 min，小心棄去上清液。沉澱空氣乾燥10min。將mRNA沉澱溶於適當體積的無RNase的雙蒸水，立即用於後續實驗，或用70%乙醇溶解，貯存於-70℃。
8、定量：測定OD260和OD280，計算產率以及OD260/OD280的比率
注意事項
1、整個操作過程必須嚴格遵守無RNase操作環境，且注意操作中的低溫要求。
2、用於純化的總RNA樣品須儘量保持RNA完整，不能被降解，獲得完整mRNA質量的前提條件。
3、總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當，若總RNA會影響mRNA純度。
4、RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結合前必須置於65℃加熱5min，其作用：（1）破壞mRNA的二級結構，特別是poly(A+)尾處的二級結構，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解離mRNA與rRNA的結合。加熱後應立即插入冰上，以免由於溫度的緩慢下降使mRNA又恢復其二級結構。
5、應注意mRNA不能被DNA汙染，否則嚴重影響實驗結果。
6、mRNA製備後，可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無DNA汙染。提取的mRNA應該在0.5~8.0kb之間呈現彌散狀，無明顯區帶，但大部分的mRNA應在1-2.0kb範圍內呈彌散狀。經過一次純化分離的mRNA還會有微量的rRNA殘留，但一般來說不會對後續實驗造成很大的影響，如果樣品純化後量足夠，可將經過一次純化分離的mRNA再純化一次，進一步提高其純度。
7、為防止mRNA降解，應避免多次凍融，可將mRNA少量分裝後保存。 也可將mRNA用70%乙醇溶解，在-70℃保存，保存時間在一年以上。
8、Oligo(dT)-纖維素柱用後可用0.3mol/l NaOH洗淨，然後用層析柱加樣緩衝液平衡，並加入0.02%疊氮鈉（NaN3)，放在4℃冰箱保存。經過預處理後可以重複使用。
