长久以来，我一直想写一篇关于miRNA的文章。在一年半前，我也与大部分医学科研工作者一样，在多个学术场合听到大咖小咖对于miRNA已经过时的论述，听得多了，内心深处难免产生微妙的抵触情绪。
而在我回到解螺旋开始系统梳理医学科研的整体方法论之后，经过多维度研究比较，我蓦然发现，其实miRNA才是当之无愧的新手之友、从SCI灌水到跨越五分档次拿国自然基金无往而不利的科研利器。
今天，我就来谈一谈选择miRNA作为研究分子类型的战术理由：
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单个变量代入五恒量，构成了最简单的疾病、表型加上分子的三要素课题。变量的分子类型很多，蛋白是经典，非编码RNA是当红趋势。非编码RNA中lncRNA、circRNA更有吸睛效应，为何miRNA还有独特优势？
1） miRNA是非编码RNA，在做“表达差异”的环节不需要进行蛋白水平的检测，不用买抗体做Western，仅qPCR检测RNA水平即可，简化了工作量。
2） 在执行“一正一反”的Gain / Loss of function过程中，miRNA的过表达和沉默都只需要订购短片段合成RNA，价格低廉且到货周期快。同时对于大部分细胞而言，用脂质体转染法可实现高效导入miRNA mimics或inhibitor到靶细胞，实验操作简单，易于重复。
由此可见，在低分灌水阶段（单变量研究，不做机制），miRNA的成文效率比做蛋白和lncRNA / circRNA高。
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进入到二元变量组合，其中最基本的套路是用通路解释机制，分子+通路的间接调控机制是最基本的四要素课题（疾病、表型、分子、机制）。
间接调控关系的口诀是“你动我也动”，即过表达或者沉默主变量，看下游因变量的随之变化。当你进行下游探索的时候，任何分子类型都执行一样的流程，但是因为miRNA过表达和沉默方便，miRNA的研究依然有一定便利之处。
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二元变量更好的模式是建立直接调控关系，也就是“知其然知其所以然”——有明确的作用靶点和调控细节。在所有的直接调控模式中，miRNA作用于靶基因的3’-UTR引起下游靶基因表达沉默是所有直接作用机制中最简单的套路，没有之一。在实验的操作性、论证的简约度上，设计miRNA二元直接机制优势非常显著：
1） 绝大部分直接机制的研究，都需要至少2个关键的实验相互佐证，比如转录因子研究有ChIP，EMSA和Luciferase Assay，蛋白-蛋白相互作用有co-IP和Pulldown实验等。
而miRNA结合靶基因的验证只有一个经典实验——荧光素酶报告基因实验（Luciferase Assay），这个实验本身就是直接作用机制研究里最容易开展的实验，也没有之一，就是最容易做的。
2） 在明确主变量、寻找相互作用的靶基因过程中，都需要走数据库预测或者实验筛选的流程，RNA和蛋白相互作用或者蛋白与蛋白相互作用预测的准确度不能说特别高，所以很多研究者会直接进行实验筛选，放弃预测环节。
而miRNA的靶基因预测可以说是其中准确率最高的作用形式，只需要在几个数据库中输入miRNA名称，即可输出预测靶基因结果，将多个数据库的预测结果取交集，再结合细胞株中过表达miRNA之后，这些靶基因是否具有下调趋势的结果，即可锁定一组直接作用分子，Luciferase Assay验证成功，即大功告成。
3） 在机制的Rescue验证环节，miRNA模式单一。经典作用是负调节下游靶基因，所以口诀是“反正正，反反反”，即上下游同时过表达或者沉默。
考虑到miRNA无论过表达还是沉默都是合成短片段，所以可以根据下游基因的操作便利度选择上游的策略。如果下游基因已经有过表达克隆，可以用反正正手段，如果下游基因没有现成的表达工具，就去合成siRNA进行沉默，用反反反同样可以快速拿到结果。
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超越了二元变量直接调控，还有更深入的机制模式，比如三元变量结构——miRNA上游再提出调控分子，解答驱动因素的问题。miRNA的转录同样需要转录因子，通过常见的转录因子机制模式我们可以建立更加复杂的信号轴关系。miRNA的启动子也能被甲基化调控，转录出来后也受到剪切过程的调节，能够讲的故事不比其他分子类型逊色多少。
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除了三元变量套路把机制推向更复杂的逻辑链条，还有一条路也适合miRNA往高分杂志走，那就是外泌体介导的细胞间通讯。外泌体+miRNA的组合是给miRNA带来全新活力的研究套路，进入到多细胞交互的科研境界，已经站在了五分以上的起点上，征服国自然基金已不在话下。这种高阶套路，我们在套路课的第3期就进行深入讲解，上半学年可学到，打好基础，不要落下学习进度。
我是酸菜，我为miRNA代言！miRNA研究有2个难点，一个是Luciferase Assay，靠你们自己突破，另一个是如何预测miRNA靶基因或者已知基因反向推测调控的miRNA，需要用到一些数据库，这些数据库虽然操作简单，但总有学员感觉难以突破。
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