NGS一直是诊断领域的热点，但由于各种原因，除产前诊断NGS以外，其他应用一直未获得国家行政机关的认可，包括在美国，获得FDA批准的NGS项目也屈指可数。近日，国家药监局先后批准了两家企业的肿瘤NGS产品上市，使得NGS技术在临床诊断领域的应用得以进一步推广，为此，基因谷特将相关评审内容为大家进行一番梳理，期望可以为科研人员、行业人士及临床医生提供更加清晰的思路。
破局的思考——“NGS肿瘤第一证”审评报告解析
本周，CFDA先是公布了燃石四基因检测试剂盒获得批准的消息，让整个行业为之激动。接着，又公开了该产品的审评报告，并且首次附上了说明书。
如果说批准这个“NGS肿瘤第一证”是对行业的一次鼓励，这次审评报告的公开可谓是给RA人员的一记福利。小编这就带你来看看，这个“第一证”是怎么批下来的。
一、产品预期用途
伴随诊断试剂一定要在预期用途中明确具有伴随用途的靶点和药物之间的对应关系。以下是燃石四基因联检试剂盒的预期用途描述：
“EGFR基因中：19 号外显子缺失 (19del)、L858R点突变用于吉非替尼片、盐酸埃克替尼片伴随诊断检测，T790M点突变用于甲磺酸奥希替尼片的伴随诊断检测；
ALK 基因中：ALK 重排(融合)用于克唑替尼胶囊的伴随诊断检测”。剩下的就是未经伴随诊断验证的靶点。
试剂盒可检测的基因及变异类型与对应药物关系，如下表所示：
二、最低检出限和阳性判断值
2.1
最低检出限
申请人选择了9份带有已知突变的临床阳性样本，和1份无突变的临床阴性样本，根据这些样本的原始突变比例，按下表进行稀释：
使用3批试剂盒，每个样本重复检测，依据该梯度研究结果：对于点突变、缺失突变，确认检测限为2%（绿色标识）；对于重排突变，确认检测限为10%（绿色标识）。ALK重排上因各家采取的策略的区别，可能最低检出限的差异会比较大。需要各厂家结合到阳性判断值，选择合适的策略加以确定。
再经参考品和临床样本验证，最终确定了该产品能够检出50ng DNA样本中突变比例低至2%的EGFR/BRAF/KRAS突变，和突变比例低至10%的ALK重排突变。
2.2
阳性判断值
这个四基因试剂盒的阳性判断值研究，也给我们提供了一个不一样的思路。 “具有双端支持（即正向和反向序列支持）的独特（即去除PCR重复）DNA片段数量” ，这个又长又绕、还得加两个括号内注释的名词可能即将火起来，取代荧光PCR的Ct值或△Ct值，领上一段时间的风骚。需要提醒的是，因采取的NGS的具体技术路径的不一样，建议各厂家根据自身产品的设计、统计学的结果，参考国内外已获批的产品或文献去选择合适的方法来确定阳性判断值。为行文方便，下面小编将之简称为“双独DNA片段数” 。
在阳性判断值的建立部分，申请人选择了54个经数字pcr方法验证的样本，统计各变异位点的双独DNA片段数。通过上述统计，来确定最合适的阳性判断值，并使用Fisher精确检验，对双独DNA片段数=2时的区别阴阳性的能力进行显著性差异检验。结果显示，双独DNA片段数≥2时，能够100%正确区分阳性和阴性结果。
在阳性判断值的验证部分，申请人用临床组织样本或细胞系构建了具有用药指导意义的基因变异阳性和阴性参考品进行检测，共获得107个样本原始数据，测试了阴、阳性符合率、重复性、最低检出限等性能，结果表明，各项性能均100%吻合。
综上，确定了双独DNA片段数≥2时，结果判断为阳性；双独DNA片段数＜2时，结果判读为阴性。（但阳性判断标准中也提到了数据下机后需要经过燃石数据分析流程处理，质控合格后的数据方进行阴/阳性判断。）
三、一致性临床研究
3.1
临床单位选择
申请人选择了如下五家临床单位：
- 四川大学华西医院
- 上海市胸科医院
- 上海市肺科医院
- 复旦大学附属肿瘤医院
- 中国医学科学院肿瘤医院
3.2
入组标准、样本例数和阳性率
入组样本主要为肺腺癌和少部分鳞癌、腺鳞癌等的FFPE样本，共计1334例。此外还入组了126例干扰样本（主要包括良性肿瘤和小细胞癌）。
本次试验共检出963例突变阳性样本，报告中给出的阳性率是66.0%，可推算是把干扰样本也计算到分母里去了。实际上如果不算干扰样本，阳性率会高达72%。
3.3
位点检出例数
各突变类型的具体检出例数如下图所示：
3.4
比对试剂和复核试剂
一致性临床研究采用与某些已上市的单个基因突变检测试剂盒和Sanger测序法进行比对。由于申请人没有追求过多的位点，整个比对试剂的选择上是比较游刃有余的，甚至可以考虑到经济适用的问题。
具体采用的比对试剂，如下表所示：
Sanger测序法在这个设计中，既是比对试剂，又是复核试剂。其用于比对试剂时，是对于19外显子缺失和ALK融合，由于比对试剂检测结果不能得出具体的缺失和融合类型，所以需要采用Sanger测序法进一步确定分型结果。
当考核试剂和比对试剂出现检测结果不一致时，采用Sanger测序法作为复核试剂。考虑到Sanger测序法的检测范围，小编猜想它可以发挥的复核作用应该也是比较有限的。这其实带来一个问题，对于在医学决定水平（或者说是cut off值）附近的不一致结果，很难做到深入的分析。不过这也是一个两难，倘若采用与Sanger测序法比对，由pcr法来复核，会更早碰到这个问题。
此外，考核试剂与比对试剂检测结果不一致的样本共45例，分析原因可以平均地分成三种类型，如下表所示：
第一种，复核结果站在考核试剂这边；
第二种，考核试剂检出的突变，属于比对试剂检测能力范围之外；
第三种，在报告中的原因表述不是很清楚，因为整个比对本来就是在不同方法之间进行的，所以小编并没有特别理解到这一条具体的指向。
3.5
统计结果
一致性研究采用卡方检验进行统计学分析，
阳性符合率为98.6%，
阴性符合率为94.0%，
总符合率为97.0%。
p-value=1，两组检测结果无差异，显示二者具有较好的检测一致性。
四、与已上市CDx的比较研究
4.1
EGFR基因与已上市CDx的比较研究
首先要厘清一个概念，什么叫已上市CDx ? 必须是按照伴随诊断试剂这一概念和相应的法规要求获批的试剂盒，才能称之为CDx。明确了这个概念，我们才知道为什么申请人要选择罗氏的cobas来比对。因为他们虽然和海吉力做了全部1460例样本的一致性比对，但海吉力并不是一款按照CDx要求批准的产品。所以他们还得额外和cobas v2再做一个比对。
不过，仔细看完了报告的朋友可能会问，那为什么ALK基因和雅培比完就作数了呢？道理还是一样的，那是因为雅培的ALK试剂盒，确实是在FDA按照CDx获批的。有的朋友可能还会问，为什么燃石要选择美国批准的cobas v2，而不是选择在中国获批的那款？……小编不能确定，不过如果有愿意从市场和法规角度来探讨原因的，可以跟小编私下交流。
言归正传，与CDx的这组比较研究，从一致性研究的5家中心共1460例样本中，选择了两家中心的232例样本（不含干扰）。其中阳性137例，阴性95例。
比对结果如下表所示：
4.2
ALK基因与已上市CDx的比较研究
细心的朋友已经发现，这部分研究和一致性研究其实是一回事。纳入了全部5家中心的全部1460例样本，同一套数据，从两个角度分析。不过，小编觉得，既然是说明用药意义，这里是否没有必要统计干扰组样本呢？
比对结果如下表所示：
在1460例里面，并没有细致提及ALK与FISH结果的不一致性会是怎么样。只是说明了不一致的样本中有两例是跟Sanger结果一致。需要考虑到方法学、临界值、融合类型的差异。
五、药物疗效相关的回顾性临床研究
5.1
吉非替尼药效相关研究
本部分试验中，申请人纳入了29例晚期非小细胞肺癌有效病例，这些病例需满足两个条件：（1）有用药前样本检测结果，且可供考核试剂复测；（2）进行了吉非替尼治疗，且可以评效。
这29例有效病例的样本，经考核试剂检测为EGFR敏感突变（L858R突变阳性或19缺失阳性），与临床既往分子检测结果一致。按照桥接试验的思路，通过观察这部分病例使用吉非替尼治疗后的临床疗效指标，可以评价EGFR敏感突变与吉非替尼治疗的药效相关性。
整个回顾试验的流程如下图所示：
以客观缓解率和疾病控制率为指标，ORR=22/29=75.9%, DCR=（22+7）/29=100%。与既往药物临床试验ORR范围基本相符。
5.2
埃克替尼药效相关研究
本部分试验中，申请人纳入了21例晚期非小细胞肺癌有效病例，这些病例需满足两个条件：（1）有用药前样本检测结果，且可供考核试剂复测；（2）进行了埃克替尼治疗，且可以评效。
这21例有效病例的样本，经考核试剂检测为L858R突变阳性或19缺失阳性，与临床既往分子检测结果一致。按照桥接试验的思路，通过观察这部分病例使用埃克替尼治疗后的临床疗效指标，可以评价EGFR敏感突变与埃克替尼治疗的药效相关性。
整个回顾试验的流程如下图所示：
以客观缓解率和疾病控制率为指标，ORR=18/21=85.7%, DCR=（18+3）/21=100%。与既往药物临床试验ORR范围基本相符。
5.3
克唑替尼药效相关研究
本部分试验中，申请人纳入了13例晚期非小细胞肺癌有效病例，这些病例需满足两个条件：（1）有用药前样本检测结果，且可供考核试剂复测；（2）进行了克唑替尼治疗，且可以评效。
这13例有效病例的样本，经考核试剂检测为ALK重排阳性，与临床既往分子检测结果一致。按照桥接试验的思路，通过观察这部分病例使用克唑替尼治疗后的临床疗效指标，可以评价ALK重排与克唑替尼治疗的药效相关性。
整个回顾试验的流程如下图所示：
以客观缓解率和疾病控制率为指标，ORR=10/13=76.9%, DCR=（10+2）/13=92.3%。与既往药物临床试验ORR范围基本相符。
5.4
奥希替尼药效相关研究
本部分试验中，申请人纳入了13例晚期非小细胞肺癌有效病例，这些病例需满足两个条件：（1）可供考核试剂复测；（2）进行了奥希替尼治疗，且可以评效。其中9例有用药前样本检测结果，有4例之前检测情况“不详”。
这13例有效病例的样本，经考核试剂检测为T790M突变阳性，有临床既往分子检测结果的，与既往结果一致。按照桥接试验的思路，通过观察这部分病例使用奥希替尼治疗后的临床疗效指标，可以评价T790M突变与奥希替尼治疗的药效相关性。
整个回顾试验的流程如下图所示：
以客观缓解率和疾病控制率为指标，ORR=11/13=84.6%，与既往药物临床试验ORR范围基本相符。报告中DCR为100%，如果不是笔误的话，小编不太确定其计算的方式。
5.5
厄洛替尼药效相关研究
本部分试验中，申请人纳入了8例晚期非小细胞肺癌有效病例，这些病例需满足两个条件：（1）有用药前样本检测结果，且可供考核试剂复测；（2）进行了厄洛替尼治疗，且可以评效。
这8例有效病例的样本，经考核试剂检测为EGFR敏感突变阳性，与临床既往分子检测结果一致。按照桥接试验的思路，通过观察这部分病例使用厄洛替尼治疗后的临床疗效指标，可以评价EGFR敏感突变与厄洛替尼治疗的药效相关性。
整个回顾试验的流程如下图所示：
以客观缓解率和疾病控制率为指标，ORR=6/8=75%, DCR=（6+2）/8=100%。
不过，最终CFDA认为该部分数据“有效样本量未达到预期统计学要求，未能进行具有统计学意义的临床研究分析”，故本次临床研究中未明确厄洛替尼与该产品的伴随关系。
六、展望
燃石本次的获批，是NGS行业为了申报付出那么多努力的回报，也是审评部门扶持创新、科学审评的成果。这次的审批通过，最终采用了附条件审批的形式，
“申请人在该产品上市后应继续 对产品伴随诊断用途进行验证。请在至少两家临床机构随访收集伴随诊断 4 种药物(吉非替尼、埃克替尼、克唑替尼、 奥希替尼)的临床用药疗效随访数据，作为临床补充资料在产品下一次延续注册时提交。 ”
在小编看来，这是一次审评艺术的体现，也是产业和监管的双赢。IVD产品的时效性、临床医生和病人对于先进技术的需求，和要求在有限时间内通过复杂的验证之间，难以平衡。通过上市后继续补充数据的方式，给予有条件的审批上市，目前看来就是一种两全其美的办法。
不过，燃石这次虽然批准了，那么是不是问题都解决了、整个NGS肿瘤审批的路径已经理顺了？后面的企业是否就可以照葫芦画瓢、油门踩到底追上来了？各家在酝酿之中的更多基因的大panel试剂盒申报是否前路一片光明？小编觉得也不尽然。
问题依然存在，而且某种程度上，燃石这次的做法也许难再效仿。阳性判断值你是否接受了“双独DNA片段数”这个概念？与比对试剂、复核试剂的检测范围和方法学差异怎么消除？与CDx比对你是否能够实现从国外试剂耗材到设备平台的一系列落地工作？回顾性研究你是否能够轻松获取理想的样本？即使各方面都能够处理，各个模块合在一起能否体现出充足的证据来支持你的申报？在今年6月高研院举办的《体外诊断试剂注册专题培训班》，来自CMDE的审评员对伴随诊断试剂未来展望也有过明确的表态，临床试验只有3条路：药物临床试验伴随、桥接试验或者Fllown on试剂对比，然而，在明确的方向下，就清楚怎样做了吗？……还有太多问题需要回答。
大家或许要问了：没批时不知道怎么做，批了也不能单纯地照猫画虎，我们到底该怎么办呢？小编觉得，回答这些问题最好的办法，其实是“科学性”三个字。如果现有的条件有局限，产业和监管理应携手一起解决这些问题，研究如何“科学破局”。申请的企业应该勇于不断寻找和探索新的验证方法，实现科学、充分验证；监管也可以不断尝试探索审评路径、审视新的理念，实现科学审评。最终大家同步实现对科学性这个大目标的追求。
NGS肿瘤再下一城——诺禾六基因审评报告解析
“孤证不立”，好事成双。在燃石四基因检测试剂盒获批1个月后，诺禾六基因试剂盒也获得批准。在付出无数探索、努力和坚持后，恭喜诺禾也得到属于自己的回报。对于整个行业来说，随着这第二只靴子落地，大家也可以明确感觉到：NGS肿瘤的春天确实是到了，不是燃石的一枝独秀带给我们的错觉。
但是正如小编在上一篇燃石解析最后的展望中提到，新技术、新产品的申报和审批，其实是一个产业和监管互相促进、一方不断寻找科学证据一方做出当前“最科学”之决定的过程。旧问题也会要求有新答法，何况还有新的问题要回答，我们还是要继续保持向前看的姿态。
一、试剂组分
没有对比就没有感触，以前试剂组分这一块小编一向觉得没什么可说的。不过在看完燃石的试剂组分后，再看到诺禾的试剂组分，明显感觉这二家之间确实采用了很不同的策略。
诺禾的试剂盒有7个模块，将近50个小单元（瓶、管、袋）；燃石是4个模块（子试剂盒），10个小单元。在部分试剂盒组成上，燃石选择了将可以分出去的成分，都分出去作为一类单独备案了。
二、产品预期用途
诺禾六基因联检试剂盒可检测的基因及变异类型与对应药物关系，如下表所示：
*红色为诺禾相比燃石多检测的基因和位点
跟燃石相比，诺禾多检测了ROS1和PIK3CA两个基因，其中更是建立了ROS1和克唑替尼的伴随关系，这一申报策略还是非常有眼光的。CFDA去年年底才刚刚批准了增加克唑替尼用于ROS1融合阳性患者的适应症。
此外，值得关注的是诺禾选择的配套仪器是达安的DA8600测序仪，该测序仪在2014年11月获批用于NIPT的检测，在2017年1月通过适应症变更增加了对“人体基因位点的检测”，将于2019年11月注册证到期。而今年早前，华大已经因为产品迭代的原因，主动注销了同期获批的两款测序仪BGISEQ-100，BGISEQ-1000。
三、最低检出限和阳性判断值
3.1
最低检出限
申请人为每种突变配制了4个频率的梯度，每个梯度重复检测10次。通过回归分析建立了DNA和RNA两种核酸类型的LoD，并经39种变异组成的参考品加以确认，如下表所示：
3.2
阳性判断值
对于DNA的阳性判断值，申请人先是采用两个低频阳性样本，采用5个不同测序深度，初步确定深度2000X时，点突变频率0.7%和插入、缺失频率1%，是比较能够有效检出突变的。并且使用1524例临床试验收集的样本进行了验证，证实该频率可以正确区分阴、阳性结果。
对于RNA的阳性判断值，申请人对6例临床样本，进行了200次重复模拟样本的分析，初步确定了融合序列支持数≥200条为阳性判断值。经临床试验收集的420例样本和46例细胞系样本进行验证，证实该融合序列支持数可以正确区分融合阴、阳性结果。
让我们比较一下LoD和阳性判断值的情况：
让我们再回忆一下燃石的做法：点突变和插入、缺失的LoD是2%，融合是10%，三者的阳性判断值都是2条双独reads。比较之下，两家的体系还是有很多不一样的地方。
由于采取的测序平台、技术原理、测序深度和分析算法的不一样，每家NGS试剂采用的信号标准和阴、阳性的补偿不一样，阳性判断值之间的差异会比较大，但只要各自的体系稳定，也不是问题。
不过在LoD上面，不仅两家之间有差异，即使是和自己体系定的阳性判断值比，也有较大的间隙。这或许跟企业要在技术验证和市场需求上取得平衡有关。
四、一致性临床研究
4.1
临床单位选择
申请人选择了如下五家临床单位：
4.2
入组标准、样本例数和阳性率
入组样本为回顾性非小细胞肺癌FFPE样本和近期临床常规病理检测剩余的FFPE样本，样本总数共计2789例。考核试剂与对比试剂检测结果不一致的样本采用相应的已上市qPCR试剂盒进行测定。
本次试验共检出1966例突变阳性样本，阳性率高达70.49%，跟燃石不算干扰样本的阳性率72%非常接近。
4.3
各基因检出例数
本次报告公开的例数不再以突变为单位显示，而是以基因为单位显示，各基因的具体检出例数如下图所示：
4.4
比对试剂和复核试剂
第一部分
一致性临床研究采用与Sanger测序法进行比对，对于不一致样本采用qPCR试剂进行复核，正好是跟燃石颠倒了一下顺序。这其实带来一个问题，对于阳性判断值附近的样本，Sanger测序已经是强弩之末了，出现不一致的可能性很大。除非很幸运入组的都是频率较高的样本，那样的话符合率数据才会很好看。但临床意义的问题依然有待论证。
让我们先来看看诺禾跟Sanger测序的比对数据：
确实非常漂亮：18个符合率里，没有低于95%的；绝大多数都在99%以上。
2789例样本里，只有83例样本不一致，涉及到86个位点。用qPCR复核后，其中62个位点与考核试剂一致；24个位点跟Sanger测序一致。也是非常漂亮！这个临床数据想必也在一定程度上支持了申请人的阳性判断值体系。
第二部分
或许是由于刚才小编所讲的原因，Sanger测序由于灵敏度的限制，在更具临床意义的区间上话语不强，即使有着非常漂亮的比对数据，依然不具备足够的说服力。因此申请人选择了和qPCR继续做了一部分比对。
这部分比对共入组了779例样本，每种基因都有100多例。让我们来看看诺禾跟qPCR比对的结果：
完全是学霸的节奏，18个数据里，17个100%，只有ALK阳性符合率为98.21%。779例样本中共有8例两种方法检测结果不一致：其中6例经对比试剂复测或Sanger测序复核，均与考核试剂一致；2例与比对试剂一致。
五、与已上市CDx的比较研究
不理解什么叫已上市CDx的朋友，可以再看看上一篇燃石的报告解析。与CDx的这组比较研究，申请人从一致性研究中选择了部分样本，还加上了一些新入组样本，所有选择样本均符合靶向药物对适应症的要求。
比对结果如下表所示：
纯粹按照性能比对来讲，结果是非常出色的。
六、药物疗效相关的回顾性临床研究
本部分试验中，申请人选择的是上一部分“与已上市CDx的比较研究”中，经考核试剂检测为阳性的样本。考虑到与CDx比对结果很出色，这句话小编觉得也可以大胆替换成“经考核试剂和已上市CDx同时检测为阳性的样本”。
回忆一下燃石的案例，也有类似表述：“基于上述两项临床研究结果，为进一步验证该产品伴随诊断性能……”。综合来说，审评在这两个案例上是接受了在与已上市CDx做性能比较的基础上，再选择有用药信息的回顾性样本加以分析，两步法来论证药物相关性这样的做法。
药物回顾性临床研究结果如下：
回顾性临床研究显示，结果与既往药物临床试验ORR范围基本相符。因此与上述药物的伴随用途得到了建立。
七、展望
从同类产品后续申报角度来讲，该展望的，其实在燃石的报告解析时都展望完了。燃石和诺禾的批准，是他们为自己开辟了道路，而不是为整个行业扫清了道路。摆在面前依然有大量存在的问题要解决。但可喜的是，监管层、临床专家也在和企业一起为之努力。
审评中心这周刚刚发布了《肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用技术审查指导原则（征求意见稿）》，为解决NGS的技术规范问题，提供很多细致的指导；
上个月，“中国临床肿瘤学会”和“中国肿瘤驱动基因分析联盟”的专家们又在中华医学杂志上刊发了《二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识》，这份共识内容非常全面，从检测流程、质量控制，到数据管理、结果报告、临床应用，无所不包。
有理由相信，在整个行业的共同努力和推动下，再新再难的产品，只要质量可靠、临床应用落到实处，都总会开花结果。只要遵循科学的方式，朝着正确的方向推动，拿出实打实的数据，所有付出也都会得到回报。
随着监管部门开始认可肿瘤领域的NGS检测产品，除了上述已获批的两项产品，已进入“绿色通道”的其他同类产品，包括南京世和的肺癌靶向药物基因突变检测试剂盒（高通量测序法）、厦门艾德的人类癌症多基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）、厦门飞朔的人类肿瘤多基因变异检测试剂盒（半导体测序法）也正在审核过程中。相信随着更多的产品获得CNDA的批准，行业竞争也将在产品上市后激烈展开。不仅如此，为了进一步规范肿瘤相关突变基因检测产品的注册申报和技术审评， CMDE于8月14日发布了关于公开征求《肿瘤相关突变基因检测试剂（高通量测序法）性能评价通用技术审查指导原则（征求意见稿）》意见的通知。体现出了监管部门对于NGS试剂盒产品的高度重视。
我们相信，NGS相关产品的丰富，将使得患者有更多选择获知罹患疾病的复杂性、治疗方案和预后，会为提高患者的治疗效果和生存质量提供更优质的服务。
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