膠質母細胞瘤中上皮-間質樣轉化機制研究進展
膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是人類最常見的原發性惡性中樞神經系統腫瘤，也是侵襲能力最強的膠質瘤。GBM的惡性進展和復發是其難以治癒的根本原因。目前，GBM尚無有效的治療方法，標準治療包括最大安全範圍手術切除或診斷性活檢，再行放化療輔助治療。然而，大多數患者將在1~2年內死亡。上皮-間質樣轉化（EMT-like）是一個上皮特性受損而間質特性增強的過程，在惡性膠質瘤侵襲和遷移過程中發揮著重要作用。因此，探索上皮間質樣轉化在GBM侵襲遷移中的作用機制對於制定新的有效的治療策略具有重要意義。
1. GBM及GICs概述
膠質瘤起始細胞（glioma initiating cells，GICs）或膠質瘤幹細胞（glioma stem cells，GSCs）的發現是膠質瘤研究的一個重要事件，深刻影響了我們對GBM發生模式、腫瘤不均一性、腫瘤細胞與微環境關係以及治療策略的研究。膠質瘤幹細胞又稱膠質瘤起始細胞（glioma initiating cells，GICs），是一種具有自我更新及無限分化潛能的腫瘤細胞，同時具有高度的侵襲遷移能力及致瘤性。GSCs通過自我更新和無限增殖維持著腫瘤細胞群的生命力；而運動和遷移能力又使腫瘤細胞的播散成為可能。GSCs也可以長時間處於休眠狀態並具有多種耐藥分子而對殺傷腫瘤細胞的外界理化因素不敏感，是腫瘤進展和復發過程中的“主角”。
惡性膠質瘤幹細胞與腫瘤組織病理及微環境關係密切。惡性膠質瘤（malignant glioma，MG）的組織學表現形式為：腫瘤細胞高度間變、有絲分裂活躍，血管增殖和（或）壞死，腫瘤細胞呈假柵欄樣圍繞壞死區並簇集在腫瘤微血管周圍，並向周圍白質浸潤。既往研究表明，GSCs也集中存在於腫瘤壞死區周邊、微血管周邊和腫瘤邊緣發生侵襲的部位，分別稱為缺氧區微環境、血管旁微環境和侵襲性微環境。GSCs的上述微環境分佈特點提示其與MG的生物學行為關係密切，乾性表型和功能狀態可由所處的微環境動態塑造。
美國癌症基因組圖譜計劃（the cancer genome atlas，TCGA）基於大樣本膠質瘤基因表達、DNA甲基化模式、信號通路活性等生物信息學分析及治療反應和生存期，將GBM 分為經典型（classical）、間質型（mesenchymal）、神經型（neural）和前神經型（preneural）。深入研究發現，這四種亞型的GBM並非是排他性獨立存在。同一患者GBM瘤內不同微環境中分佈著不同亞型表型的GSCs，如微血管周圍主要分佈前神經亞型GSCs，而缺氧區則主要分佈著間質亞型GSCs，而不同表型GSCs的優勢比例在不同GBM標本中也有所不同。利用單細胞RNA和基因組測序分析證明，GSCs轉錄譜也具有多樣性，進一步提示其分子遺傳背景的複雜和不均一性。
2. EMT及EMT-like概述
在20世紀60年代後期，Hay等第一次正式提出EMT這一概念，展示了EMT在正常胚胎形成中的重要性，即在原腸胚形成期間上皮來源的細胞從胚胎的表面進入胚胎內部，形成中胚層。在20世紀80年代，Greenburg和Hay描述了成人和胚胎上皮細胞表型中的EMT。自20世紀90年代起，越來越多的證據表明EMT也與腫瘤的進展密切相關。
GBM中的EMT近些年才逐漸被人們所重視。然而，GBM進展期間發生的並非是完全的EMT，而是類似上皮-間質轉化的轉變過程，稱之為上皮間質樣轉化（EMT-like）。它是指一種上皮表型較少並且更加偏向於間質表型的狀態過程，主要表現為上皮標誌物如E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和緊密連接蛋白1（ZO-1）的表達下調並誘導間質標記物如N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、纖連蛋白（Fibronectin，FN）、波形蛋白（Vimentin）和鋅指E盒結合蛋白1（ZEB1）的升高；從而導致細胞間粘附能力的減弱及細胞極性喪失，最終增強了腫瘤的侵襲和遷移能力。因此理解GBM進展期間EMT的分子調控機制將變得更加重要。下文重點從EMT主要信號通路及轉錄因子、miRNA、腫瘤幹細胞、缺氧微環境、治療抵抗等方面進行闡述。
3. 主要相關信號通路
3.1 TGFβ/Smad
TGFβ與Ⅰ型（TβRⅠ或TGFR1）和Ⅱ型（TβRⅡ或TGFR2）受體結合時，激活Smad2和Smad3，然後再與胞質內的Smad4結合。Smad三聚體複合物進入細胞核內，結合DNA特異位點抑制（如E-cadherin，occludin）或激活（如Snail、Zeb、Twist、FN、Vimentin）靶基因的轉錄。有趣的是，TGF-β信號通路不僅激活EMT相關轉錄因子的表達，而且也與這些轉錄因子協同增加其轉錄活動。
在GBM細胞系的體內體外試驗中，TGFβ 有潛在誘導EMT 的作用，如用TGFβ 處理過的U87 和U251 膠質瘤細胞能夠通過Smad2信號通路的誘導發生間質樣轉化，表現為膠質瘤細胞發生形態學改變、間質標誌物表達上調，膠質瘤細胞的侵襲、遷移能力增強。
3.2 Wnt/β-Catenin信號通路
經典的Wnt信號傳導通路是由β-Catenin介導，β-Catenin對於EMT具有雙重作用，既可作為黏附連接的組成部分，將E-cadherin連接於細胞骨架，又可以轉運到細胞核驅動靶基因的轉錄。在不存在Wnt的情況下，糖原合成激酶-3β（GSK-3β）磷酸化β-Catenin並將其靶向泛素化並降解，從而將細胞質β-Catenin維持在低水平。Wnt配體與Frizzled（FZD）受體的結合導致GSK-3β 的抑制，因此阻止了β-Catenin磷酸化並導致其胞質內的積聚，然後可以進入細胞核並調節靶基因的轉錄，同時降低鈣黏素介導的黏附能力。
Wnt/β-Catenin信號通路已經被證明與膠質瘤進展和患者總生存率的下降密切相關，並且其在膠質瘤EMT中的作用也逐漸被人們所關注。有研究通過對30例間質型GBM患者的標本進行評估顯示Wnt/β-Catenin信號通路被高度激活；此外，這些患者膠質瘤細胞中EMT相關轉錄因子如ZEB1、Twist、Snai和Slug的表達明顯上調，最終導致膠質瘤細胞的侵襲、遷移能力明顯增強。
3.3 轉錄因子
在膠質瘤細胞中，這些不同的信號轉導通路通過激活在一些分子量相對較小的轉錄因子，進而協調EMT 相關基因的表達。這些轉錄因子統稱為“EMT誘導轉錄因子（EMT-TFs）”，並且可以分為三類不同的蛋白質家族：即Snail 家族（包括Snail 和Slug），ZEB 家族（包括ZEB1 和ZEB2）和鹼性螺旋-環-螺旋結構（包括TWIST1、TWIST2和TCF3）家族。EMT的主要調控因子通過啟動子的活化或抑制來控制EMT相關基因的轉錄，最終在不同程度上抑制上皮表型相關基因的表達如E-cadherin，而上調間質表型相關基因的表達包括N-cadherin、FN 和Vimentin等。
在人GBM細胞系中，體外敲低膠質瘤細胞Snail1通過減少Vimentin並增加E-cadherin的表達來削弱GBM細胞的增殖、侵襲和遷移能力。Slug也參與膠質瘤惡性進展，因為其在GBM患者中呈高表達，與GBM 患者的分級和預後密切相關。轉錄因子ZEB1在GBM進展中起重要作用，並且作為一種致瘤因子與GBM 患者的生存期呈負相關。當用敲低ZEB1的GBM細胞原位接種在小鼠顱內時，與空白對照相比，敲低組腫瘤侵襲能力明顯降低，並且表現出對替莫唑胺的敏感性增加。ZEB2在GBM患者中呈高表達並且與腫瘤進展密切相關。體外研究發現，敲低ZEB2能夠增加E-cadherin的表達，並下調EMT 標誌物的表達，如β-catenin、Vimentin、N-cad⁃herin和Snail，並且削弱膠質瘤細胞增殖、侵襲和遷移能力。體外實驗提示，敲低Twist1不僅能夠下調EMT相關標誌物如N-cadherin、Vimentin、β-catenin，而且還能降低神經幹細胞標誌物如Sox2的表達；同樣，敲低Sox2也能夠下調Twist1的表達，提示Twist1和Sox2 都能維持膠質瘤幹細胞的乾性和誘導EMT。裸鼠原位膠質瘤顱內模擬實驗提示：過表達Twist1能夠明顯增加膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力。
4. EMT與微小RNA（miRNA）
近年來，愈來愈多的研究報道miRNA在膠質瘤的發生、發展、侵襲和遷移過程中發揮著至關重要的作用。下文重點對參與膠質瘤EMT過程的部分miRNA進行總結。miR-200家族由5個miRNA序列組成，主要通過靶向ZEB家族調節膠質瘤的進展和EMT。對GBM樣本全基因組miRNA表達譜的分析表明：miR-200c表達缺失與ZEB1過表達密切相關，提示miR-200c通過ZEB1參與膠質瘤的侵襲遷移。另一種靶向ZEB基因的miRNA是miR-590-3p，其在GBM患者組織樣本和GBM細胞系中的表達是下調的。相反，當過表達miR-590-3p時，其可以通過靶向ZEB1和ZEB2 基因抑制膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力。
miRNA-203是另一種在GBM中具有重要作用的miRNA，與WHOⅠ/Ⅱ級GBM患者樣本相比，Ⅲ/Ⅳ級GBM患者樣本miR-203表達下調並且與Slug表達水平呈負相關。研究提示miRNA-203靶向Slug抑制膠質瘤的EMT，並降低化療抵抗；miR-203在伊馬替尼耐藥的GBM細胞系中表達明顯下調，並且這些耐藥細胞系表現出EMT特點（上皮表型標誌物如E-cadherin表達下調、間質表型標誌物如ZEB1和Vimentin表達上調）和侵襲遷移能力明顯增強。
5. EMT與腫瘤幹細胞（cancer stem cells，CSCs）
CSCs被認為是腫瘤形成過程的細胞“驅動器”，現有研究表明：GSCs與膠質瘤的高侵襲能力和治療抵抗密切相關。EMT似乎參與了腫瘤細胞獲得乾性的過程，腫瘤細胞通過獲得乾性，最終導致腫瘤的復發和轉移。最近有研究顯示在GBM細胞中敲除ZEB1能夠抑制膠質瘤幹細胞標記物SOX2、CD133和OLIG2 的表達，提示EMT 與乾性之間密切相關。因此，GSCs有可能通過經歷EMT提高侵襲、遷移能力進而來促進膠質瘤的惡性進展。另一方面，有研究提示幹細胞能夠釋放細胞因子和趨化因子來調節膠質瘤的惡性進展及EMT過程，如通過共培養富含CD133+的膠質瘤細胞與人臍帶血幹細胞（hUCBSC）發現能夠明顯降低膠質瘤細胞的侵襲、遷移能力，並下調N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Twist1和Sox2的表達，而上調E-cadherin的表達。
有研究發現利用大鼠脂肪幹細胞來源的條件培養基能夠誘導C6膠質瘤細胞的EMT過程，並明顯增強其侵襲、遷移能力，以及上調Vimentin、MMP-2、N-cadherin，而降低E-cadherin的表達。以上研究支持這樣的觀點：即一旦膠質瘤細胞遠離腫瘤區域滲入周圍腦實質，膠質瘤幹細胞的乾性特徵就會與其間質表型特徵作出同步的調節，並且這種同步調節對於膠質瘤的侵襲、遷移至關重要。
6. EMT與缺氧
缺氧在實體瘤中經常發生如GBM，主要原因是由於血流量有限，當腫瘤細胞的生長速度超過其血液供應，細胞就會出現缺氧狀態。GBM壞死區域通常被典型的“柵欄樣（pseudopalisading）細胞”包圍，這些細胞的特點是均過度表達HIF-1，是惡性膠質腫瘤的標誌之一。缺氧微環境誘導人GBM細胞發生EMT，主要表現為形態學改變、侵襲及遷移能力增強。有研究通過用敲低ZEB1的膠質瘤細胞暴露於缺氧條件下時發現，空白敲低組膠質瘤細胞間質標誌物過表達及侵襲和遷移能力增強，而敲低組間質標誌物未見明顯升高並且侵襲能力顯著減弱，提示ZEB1能夠介導缺氧誘導的EMT。
有研究發現用貝伐單抗（bevacizumab）治療的GBM患者標本中的間質標誌物MMP2、Zeb1、Zeb2、Snail、Slug和Twist的表達是上調的，這些結果進一步表明，抗血管生成療法能產生更加缺氧的環境，誘導GBM 細胞發生EMT。
儘管人們努力尋找不同的分子靶向藥物並聯合傳統的抗癌療法，對抗許多類型的腫瘤，但目前無任何療法被證明是完全有效的。GBM標準治療方案包括放療和替莫唑胺（TMZ）化療可能在治療的同時通過促進EMT過程導致腫瘤的惡性進展。因此，通過治療腫瘤的同時發生EMT可能為GBM複發率仍然很高提供了可能的解釋。如ZEB1能夠通過誘導c-MYB、miR-200 和MGMT，使人類GBM 細胞發生TMZ抵抗。甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶（O6-methyl-guanine-DNA methyltransferase，MGMT）是一種重要的DNA修復蛋白，還是參與化療耐藥的主要酶，主要受到原癌基因c-MYB的調控；而miR-200不僅能夠抑制c-MYB，還能抑制ZEB1。當用敲低ZEB1 的GBM細胞原位接種在小鼠顱內時並接受TMZ治療，與空白敲低組相比，小鼠存活率明顯增加；體內試驗結果支持上述觀點。
8. 小結與展望
綜上所述，GBM中的EMT是一個由複雜的調控網絡構成的過程，深入研究EMT的分子機制有助於我們更深刻地認識GBM的發生發展和侵襲遷移的過程。近些年，EMT已成為腫瘤領域研究的熱點之一，其在GBM侵襲遷移中的作用逐漸被人們所認識、關注。未來的研究應該包括對EMT標誌物的經典組織學評估以及對腫瘤實質和腫瘤浸潤區基因組分析；若EMT依賴性GBM浸潤的理論是真實的，那麼EMT抑制劑聯合應用於惡性膠質瘤患者可能會產生較好的治療效果；治療前的EMT指標特徵作為常規診斷工具的一部分，將有助於對GBM患者微轉移形成和多灶性生長的風險評估。對於那些已經發生EMT的GBM患者則應更頻繁地使用MRI或PET監測早期腫瘤播散並接受由EMT抑制劑和經典標準治療構成的聯合方案。因此，繼續探索GBM中EMT過程的分子機制，將為我們治療GBM提供嶄新的思路。
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