胶质母细胞瘤中上皮-间质样转化机制研究进展
胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是人类最常见的原发性恶性中枢神经系统肿瘤，也是侵袭能力最强的胶质瘤。GBM的恶性进展和复发是其难以治愈的根本原因。目前，GBM尚无有效的治疗方法，标准治疗包括最大安全范围手术切除或诊断性活检，再行放化疗辅助治疗。然而，大多数患者将在1~2年内死亡。上皮-间质样转化（EMT-like）是一个上皮特性受损而间质特性增强的过程，在恶性胶质瘤侵袭和迁移过程中发挥着重要作用。因此，探索上皮间质样转化在GBM侵袭迁移中的作用机制对于制定新的有效的治疗策略具有重要意义。
1. GBM及GICs概述
胶质瘤起始细胞（glioma initiating cells，GICs）或胶质瘤干细胞（glioma stem cells，GSCs）的发现是胶质瘤研究的一个重要事件，深刻影响了我们对GBM发生模式、肿瘤不均一性、肿瘤细胞与微环境关系以及治疗策略的研究。胶质瘤干细胞又称胶质瘤起始细胞（glioma initiating cells，GICs），是一种具有自我更新及无限分化潜能的肿瘤细胞，同时具有高度的侵袭迁移能力及致瘤性。GSCs通过自我更新和无限增殖维持着肿瘤细胞群的生命力；而运动和迁移能力又使肿瘤细胞的播散成为可能。GSCs也可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，是肿瘤进展和复发过程中的“主角”。
恶性胶质瘤干细胞与肿瘤组织病理及微环境关系密切。恶性胶质瘤（malignant glioma，MG）的组织学表现形式为：肿瘤细胞高度间变、有丝分裂活跃，血管增殖和（或）坏死，肿瘤细胞呈假栅栏样围绕坏死区并簇集在肿瘤微血管周围，并向周围白质浸润。既往研究表明，GSCs也集中存在于肿瘤坏死区周边、微血管周边和肿瘤边缘发生侵袭的部位，分别称为缺氧区微环境、血管旁微环境和侵袭性微环境。GSCs的上述微环境分布特点提示其与MG的生物学行为关系密切，干性表型和功能状态可由所处的微环境动态塑造。
美国癌症基因组图谱计划（the cancer genome atlas，TCGA）基于大样本胶质瘤基因表达、DNA甲基化模式、信号通路活性等生物信息学分析及治疗反应和生存期，将GBM 分为经典型（classical）、间质型（mesenchymal）、神经型（neural）和前神经型（preneural）。深入研究发现，这四种亚型的GBM并非是排他性独立存在。同一患者GBM瘤内不同微环境中分布着不同亚型表型的GSCs，如微血管周围主要分布前神经亚型GSCs，而缺氧区则主要分布着间质亚型GSCs，而不同表型GSCs的优势比例在不同GBM标本中也有所不同。利用单细胞RNA和基因组测序分析证明，GSCs转录谱也具有多样性，进一步提示其分子遗传背景的复杂和不均一性。
2. EMT及EMT-like概述
在20世纪60年代后期，Hay等第一次正式提出EMT这一概念，展示了EMT在正常胚胎形成中的重要性，即在原肠胚形成期间上皮来源的细胞从胚胎的表面进入胚胎内部，形成中胚层。在20世纪80年代，Greenburg和Hay描述了成人和胚胎上皮细胞表型中的EMT。自20世纪90年代起，越来越多的证据表明EMT也与肿瘤的进展密切相关。
GBM中的EMT近些年才逐渐被人们所重视。然而，GBM进展期间发生的并非是完全的EMT，而是类似上皮-间质转化的转变过程，称之为上皮间质样转化（EMT-like）。它是指一种上皮表型较少并且更加偏向于间质表型的状态过程，主要表现为上皮标志物如E-钙黏蛋白（E-cadherin）和紧密连接蛋白1（ZO-1）的表达下调并诱导间质标记物如N-钙黏蛋白（N-cadherin）、纤连蛋白（Fibronectin，FN）、波形蛋白（Vimentin）和锌指E盒结合蛋白1（ZEB1）的升高；从而导致细胞间粘附能力的减弱及细胞极性丧失，最终增强了肿瘤的侵袭和迁移能力。因此理解GBM进展期间EMT的分子调控机制将变得更加重要。下文重点从EMT主要信号通路及转录因子、miRNA、肿瘤干细胞、缺氧微环境、治疗抵抗等方面进行阐述。
3. 主要相关信号通路
3.1 TGFβ/Smad
TGFβ与Ⅰ型（TβRⅠ或TGFR1）和Ⅱ型（TβRⅡ或TGFR2）受体结合时，激活Smad2和Smad3，然后再与胞质内的Smad4结合。Smad三聚体复合物进入细胞核内，结合DNA特异位点抑制（如E-cadherin，occludin）或激活（如Snail、Zeb、Twist、FN、Vimentin）靶基因的转录。有趣的是，TGF-β信号通路不仅激活EMT相关转录因子的表达，而且也与这些转录因子协同增加其转录活动。
在GBM细胞系的体内体外试验中，TGFβ 有潜在诱导EMT 的作用，如用TGFβ 处理过的U87 和U251 胶质瘤细胞能够通过Smad2信号通路的诱导发生间质样转化，表现为胶质瘤细胞发生形态学改变、间质标志物表达上调，胶质瘤细胞的侵袭、迁移能力增强。
3.2 Wnt/β-Catenin信号通路
经典的Wnt信号传导通路是由β-Catenin介导，β-Catenin对于EMT具有双重作用，既可作为黏附连接的组成部分，将E-cadherin连接于细胞骨架，又可以转运到细胞核驱动靶基因的转录。在不存在Wnt的情况下，糖原合成激酶-3β（GSK-3β）磷酸化β-Catenin并将其靶向泛素化并降解，从而将细胞质β-Catenin维持在低水平。Wnt配体与Frizzled（FZD）受体的结合导致GSK-3β 的抑制，因此阻止了β-Catenin磷酸化并导致其胞质内的积聚，然后可以进入细胞核并调节靶基因的转录，同时降低钙黏素介导的黏附能力。
Wnt/β-Catenin信号通路已经被证明与胶质瘤进展和患者总生存率的下降密切相关，并且其在胶质瘤EMT中的作用也逐渐被人们所关注。有研究通过对30例间质型GBM患者的标本进行评估显示Wnt/β-Catenin信号通路被高度激活；此外，这些患者胶质瘤细胞中EMT相关转录因子如ZEB1、Twist、Snai和Slug的表达明显上调，最终导致胶质瘤细胞的侵袭、迁移能力明显增强。
3.3 转录因子
在胶质瘤细胞中，这些不同的信号转导通路通过激活在一些分子量相对较小的转录因子，进而协调EMT 相关基因的表达。这些转录因子统称为“EMT诱导转录因子（EMT-TFs）”，并且可以分为三类不同的蛋白质家族：即Snail 家族（包括Snail 和Slug），ZEB 家族（包括ZEB1 和ZEB2）和碱性螺旋-环-螺旋结构（包括TWIST1、TWIST2和TCF3）家族。EMT的主要调控因子通过启动子的活化或抑制来控制EMT相关基因的转录，最终在不同程度上抑制上皮表型相关基因的表达如E-cadherin，而上调间质表型相关基因的表达包括N-cadherin、FN 和Vimentin等。
在人GBM细胞系中，体外敲低胶质瘤细胞Snail1通过减少Vimentin并增加E-cadherin的表达来削弱GBM细胞的增殖、侵袭和迁移能力。Slug也参与胶质瘤恶性进展，因为其在GBM患者中呈高表达，与GBM 患者的分级和预后密切相关。转录因子ZEB1在GBM进展中起重要作用，并且作为一种致瘤因子与GBM 患者的生存期呈负相关。当用敲低ZEB1的GBM细胞原位接种在小鼠颅内时，与空白对照相比，敲低组肿瘤侵袭能力明显降低，并且表现出对替莫唑胺的敏感性增加。ZEB2在GBM患者中呈高表达并且与肿瘤进展密切相关。体外研究发现，敲低ZEB2能够增加E-cadherin的表达，并下调EMT 标志物的表达，如β-catenin、Vimentin、N-cad⁃herin和Snail，并且削弱胶质瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力。体外实验提示，敲低Twist1不仅能够下调EMT相关标志物如N-cadherin、Vimentin、β-catenin，而且还能降低神经干细胞标志物如Sox2的表达；同样，敲低Sox2也能够下调Twist1的表达，提示Twist1和Sox2 都能维持胶质瘤干细胞的干性和诱导EMT。裸鼠原位胶质瘤颅内模拟实验提示：过表达Twist1能够明显增加胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。
4. EMT与微小RNA（miRNA）
近年来，愈来愈多的研究报道miRNA在胶质瘤的发生、发展、侵袭和迁移过程中发挥着至关重要的作用。下文重点对参与胶质瘤EMT过程的部分miRNA进行总结。miR-200家族由5个miRNA序列组成，主要通过靶向ZEB家族调节胶质瘤的进展和EMT。对GBM样本全基因组miRNA表达谱的分析表明：miR-200c表达缺失与ZEB1过表达密切相关，提示miR-200c通过ZEB1参与胶质瘤的侵袭迁移。另一种靶向ZEB基因的miRNA是miR-590-3p，其在GBM患者组织样本和GBM细胞系中的表达是下调的。相反，当过表达miR-590-3p时，其可以通过靶向ZEB1和ZEB2 基因抑制胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。
miRNA-203是另一种在GBM中具有重要作用的miRNA，与WHOⅠ/Ⅱ级GBM患者样本相比，Ⅲ/Ⅳ级GBM患者样本miR-203表达下调并且与Slug表达水平呈负相关。研究提示miRNA-203靶向Slug抑制胶质瘤的EMT，并降低化疗抵抗；miR-203在伊马替尼耐药的GBM细胞系中表达明显下调，并且这些耐药细胞系表现出EMT特点（上皮表型标志物如E-cadherin表达下调、间质表型标志物如ZEB1和Vimentin表达上调）和侵袭迁移能力明显增强。
5. EMT与肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）
CSCs被认为是肿瘤形成过程的细胞“驱动器”，现有研究表明：GSCs与胶质瘤的高侵袭能力和治疗抵抗密切相关。EMT似乎参与了肿瘤细胞获得干性的过程，肿瘤细胞通过获得干性，最终导致肿瘤的复发和转移。最近有研究显示在GBM细胞中敲除ZEB1能够抑制胶质瘤干细胞标记物SOX2、CD133和OLIG2 的表达，提示EMT 与干性之间密切相关。因此，GSCs有可能通过经历EMT提高侵袭、迁移能力进而来促进胶质瘤的恶性进展。另一方面，有研究提示干细胞能够释放细胞因子和趋化因子来调节胶质瘤的恶性进展及EMT过程，如通过共培养富含CD133+的胶质瘤细胞与人脐带血干细胞（hUCBSC）发现能够明显降低胶质瘤细胞的侵袭、迁移能力，并下调N-cadherin、β-catenin、Vimentin、Twist1和Sox2的表达，而上调E-cadherin的表达。
有研究发现利用大鼠脂肪干细胞来源的条件培养基能够诱导C6胶质瘤细胞的EMT过程，并明显增强其侵袭、迁移能力，以及上调Vimentin、MMP-2、N-cadherin，而降低E-cadherin的表达。以上研究支持这样的观点：即一旦胶质瘤细胞远离肿瘤区域渗入周围脑实质，胶质瘤干细胞的干性特征就会与其间质表型特征作出同步的调节，并且这种同步调节对于胶质瘤的侵袭、迁移至关重要。
6. EMT与缺氧
缺氧在实体瘤中经常发生如GBM，主要原因是由于血流量有限，当肿瘤细胞的生长速度超过其血液供应，细胞就会出现缺氧状态。GBM坏死区域通常被典型的“栅栏样（pseudopalisading）细胞”包围，这些细胞的特点是均过度表达HIF-1，是恶性胶质肿瘤的标志之一。缺氧微环境诱导人GBM细胞发生EMT，主要表现为形态学改变、侵袭及迁移能力增强。有研究通过用敲低ZEB1的胶质瘤细胞暴露于缺氧条件下时发现，空白敲低组胶质瘤细胞间质标志物过表达及侵袭和迁移能力增强，而敲低组间质标志物未见明显升高并且侵袭能力显著减弱，提示ZEB1能够介导缺氧诱导的EMT。
有研究发现用贝伐单抗（bevacizumab）治疗的GBM患者标本中的间质标志物MMP2、Zeb1、Zeb2、Snail、Slug和Twist的表达是上调的，这些结果进一步表明，抗血管生成疗法能产生更加缺氧的环境，诱导GBM 细胞发生EMT。
尽管人们努力寻找不同的分子靶向药物并联合传统的抗癌疗法，对抗许多类型的肿瘤，但目前无任何疗法被证明是完全有效的。GBM标准治疗方案包括放疗和替莫唑胺（TMZ）化疗可能在治疗的同时通过促进EMT过程导致肿瘤的恶性进展。因此，通过治疗肿瘤的同时发生EMT可能为GBM复发率仍然很高提供了可能的解释。如ZEB1能够通过诱导c-MYB、miR-200 和MGMT，使人类GBM 细胞发生TMZ抵抗。甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（O6-methyl-guanine-DNA methyltransferase，MGMT）是一种重要的DNA修复蛋白，还是参与化疗耐药的主要酶，主要受到原癌基因c-MYB的调控；而miR-200不仅能够抑制c-MYB，还能抑制ZEB1。当用敲低ZEB1 的GBM细胞原位接种在小鼠颅内时并接受TMZ治疗，与空白敲低组相比，小鼠存活率明显增加；体内试验结果支持上述观点。
8. 小结与展望
综上所述，GBM中的EMT是一个由复杂的调控网络构成的过程，深入研究EMT的分子机制有助于我们更深刻地认识GBM的发生发展和侵袭迁移的过程。近些年，EMT已成为肿瘤领域研究的热点之一，其在GBM侵袭迁移中的作用逐渐被人们所认识、关注。未来的研究应该包括对EMT标志物的经典组织学评估以及对肿瘤实质和肿瘤浸润区基因组分析；若EMT依赖性GBM浸润的理论是真实的，那么EMT抑制剂联合应用于恶性胶质瘤患者可能会产生较好的治疗效果；治疗前的EMT指标特征作为常规诊断工具的一部分，将有助于对GBM患者微转移形成和多灶性生长的风险评估。对于那些已经发生EMT的GBM患者则应更频繁地使用MRI或PET监测早期肿瘤播散并接受由EMT抑制剂和经典标准治疗构成的联合方案。因此，继续探索GBM中EMT过程的分子机制，将为我们治疗GBM提供崭新的思路。
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