抗击疟疾的血泪史
近200年来，随着流行病学和免疫学的进步，在疫苗的帮助下，大部分致命传染病（像天花）要么被消灭，要么被严密控制。相比之下，疟疾这个困扰人类健康数千年的恶魔却依然肆虐非常。疟疾多难战胜？早在公元5世纪，强盛的罗马帝国尽管铁蹄踏遍欧亚大陆，而一场突如其来的疟疾就能每天夺去数千人的生命，最终一半居民死于此病。再看如今，据世界卫生组织（WHO）上个月刚刚发布的《2018年世界疟疾报告》，2017年全世界共发生约2.19亿例疟疾，其中约435,000例死亡，死者中超过61%都是5岁以下儿童！与之相比，2010年发病人数是2.37亿，2015年是2.11亿。[1] 人类与疟疾之战依旧处于胶着状态，难言获胜。在与疟疾的斗争中，许多英雄横空出世，例如Ronald Ross、Charles Louis Alphonse Laveran、Paul Hermann Müller和屠呦呦教授分别获得1902、1907、1948和2015年诺贝尔奖，另外有机合成大师Woodward也因为抗疟疾药金鸡纳生物碱的不对称合成开创了立体选择性有机合成先河。
疟疾发病率分布图。图片来源：WHO [2]
中医“治未病”思想与疟疾的防治策略
疟疾难以消除的根本原因是疟原虫容易产生抗药性。比如1960年时，氯喹和磺胺类抗疟疾药（阻断叶酸合成进而影响DNA复制）的治愈率接近95%以上，但是几年后降至20%。而我们熟知的一线抗疟疾神药——青蒿素及其衍生物，近年来也发现其治疗效率逐步下降 [3]。目前治疗疟疾的策略陷入了尴尬的循环：发病后治疗 → 疟原虫进化出抗药性或复发 → 再开发新药或新的药物组合 → 再次产生抗药性或复发……这就好比我们追着疟原虫尾巴跑，打到一种，还有更多跳出来。此外，疟疾也很难预防。目前还没有非常可靠的疟疾疫苗问世，WHO推荐的“杀虫剂处理过的蚊帐”和“病媒控制”这两大措施还无法做到万无一失。
疟原虫如此难缠，主要与它们复杂的生活史有关。疟原虫的宿主有两个——人类和按蚊，生活史分三个阶段：红细胞外期（exo-erythrocytic cycle），子孢子（sporozoite）感染人类肝细胞并获取营养产生裂殖子（merozoite），这段时间没有任何症状，也很难检测；红细胞内期（erythrocytic cycle），除进行裂体增殖外，部分裂殖子侵入红细胞后形成配子体（gametocyte），这一时期红细胞被大量破坏，产生症状；子孢子期（sporogonic cycle），含有配子体的血液被蚊子吸取，配子体在蚊胃中发育成熟进行配子生殖，最后产生子孢子进入蚊子的唾液腺，有机会再次感染人体。目前的抗疟疾药物主要打击红细胞内期的疟原虫，虽这一部分被消灭，但肝细胞内的疟原虫还在悄悄潜伏，它们还可能继续进行裂体增殖，从而再次侵入红细胞使疟疾复发。而且，这个时期疟原虫数量不过数百，而红细胞内期则暴增至数十亿，如此强大的增殖能力给疟原虫进化出抗药性提供了充分的保障。因此，
红细胞外期的存在是疟疾复发和产生抗药性的根源。 疟原虫生活史：A. 红细胞外期；B. 红细胞内期；C. 子孢子期。图片来源：CDC [4]
很自然的，科学家想到在没有症状的红细胞外期进行干预，既可以阻止疟疾进展又可以克服耐药性问题，起到类似疫苗的预防作用。这就和中医“治未病”的理论不谋而合。然而，这种朴素的思想在疟疾上却一直很难实现，开发特异性杀灭肝细胞中子孢子的药物进展艰难。一个重要的原因在于，验证化合物抑制子孢子活性的体外实验很难进行。子孢子至今都无法在实验室内进行无污染培养，科学家只能先在实验室产生被配子体感染的蚊子，随后人工解剖蚊子，分离出被孢子体感染的唾液腺。
2016年，美国加州大学圣地亚哥分校（UCSD）Stephan Meister和Elizabeth A. Winzeler等研究者终于发明了一种方法来高通量筛选可杀灭肝细胞中子孢子的药物。[5] 他们随后依靠这个方法，花费大量精力筛选出新的预防性抗疟疾药物和新的作用靶点，结果发表在顶级期刊Science 上。
这篇Science，真心不容易
我们先从他们发明的高通量筛选方法说起。这种体外筛选模型的建立和初步筛选，数字背后都有实验人员的“血和泪”：
历时2年，每周解剖约1,000只被感染的蚊子，从总数近百万个蚊子唾液腺中分离表达荧光素的疟原虫Plasmodium berghei 的子孢子（代表红细胞外期的肝细胞感染阶段），铺在已用过化合物处理的人肝癌细胞HepG2上，如果疟原虫成功感染HepG2（即使仅1%），在荧光素存在下就会发出荧光，仪器便能读出光强度，光强度与感染率成一定比例，由此判断感染比例。幸运的是，这种荧光测试可以通过1536孔板来进行。
随后，他们历时
18个月，将Charles River化合物库（分子量60-1298 Da，基本满足Lipinski五规则）的538,273个小分子进行高通量筛选（平均每周筛约20,000个，因为有些需要重复实验，当然产生细胞毒的也要排除）。经过三轮筛选（每轮标准不同）留下半数抑制浓度IC50小于1 μM的631个化合物待靶点验证。值得一提的是，这次发现的不少化合物骨架，在此前并没有报道可用于疟疾的预防和治疗。
通过代谢组学分析，发现13种代表化合物（Tanimoto相似性很小，说明这些化合物和之前报道的抗疟疾药结构类型差别较大）中10个与线粒体电子转移链（mETC）有关。利用转基因的高表达二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）的疟原虫，这些化合物的EC50变化很大（24-1000倍），表明作用于DHODH。此外，研究者认为还有化合物可能具有先前未知的作用机制。
小结
科学家通过使用可评估化合物对红细胞外期阶段疟原虫抑制活性的高通量体外筛选实验，历时两年从上百万只蚊子和数十万化合物库中筛选出一系列具有新颖骨架的抗疟疾苗头化合物，并验证其作用于线粒体呼吸链靶点DHODH，有望大大促进预防和治疗疟疾的药物的开发。但不得不说，从苗头化合物到最终的上市药物，科学家们还有更多困难要克服。衷心希望有一天，能够开发出优秀的“化合物疫苗”，将疟疾这一顽疾扼杀在作恶之前。
原文
Open-source discovery of chemical leads for next-generation chemoprotective antimalarials
Science, 2018, DOI: 10.1126/science.aat9446
参考文献：
1.https://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2018/en/
2.http://www.who.int/gho/malaria/en/
3. B. Blasco et al., Antimalarial drug resistance: Linking Plasmodium falciparum parasite biology to the clinic. Nat. Med., 2017, 23, 917-928.
4.https://www.cdc.gov/malaria/about/biology/
5. J. Swann et al., High-throughput luciferase-based assay for the discovery of therapeutics that prevent malaria. ACS Infect. Dis., 2016, 2, 281–293
（本文由西北望供稿）
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