超分子籠化身“快遞小哥”，細胞裡也能“送貨上門”

瞭解藥物傳遞系統如何成功地靶向細胞內細胞器（subcellular compartment），在生物納米技術、細胞生物學和納米治療等許多領域具有重大意義。雖然各種納米顆粒（NPs）、穿膜肽（CPPs）、碳納米管（CNTs）甚至金屬有機框架（MOFs）都被用做“貨物載體”，把外界生物活性物質運輸到細胞內，然而細胞內運輸與這些系統結構性能的基本關係，迄今卻很少討論。由於尺寸較小（1-10納米）和官能團修飾方便，

最近，美國德州農工大學（Texas A&M University）化學學院的周宏才教授課題組聯合該校生物化學和生物物理學院的Jean-Phillippe Pellois教授課題組，報道了三種具有不同電荷的多孔配位籠，包裹藥物，實現細胞內不同細胞器的靶向釋放，達到調控抗癌活性的結果。第一作者為方煜博士，並且得到了德州農工大學生物系Beiyan Nan博士和中科院北化所黃嫣嫣博士的大力支持。

圖1. 三種多孔配位籠設計和晶體結構。圖片來源：Small

作者首先篩選了幾種超分子籠。他們選擇了已報道超分子籠結構中最為普遍的拓撲結構之一的八面體（圖1）。根據這個拓撲結構，他們合成了一種自帶熒光的PCC-1，以及之前報道過的PCC-2和PCC-3。這種三種超分子籠都是正八面體籠狀結構，外徑尺寸分別為5.0納米、4.2納米和2.8納米。PCC-1和PCC-2是由三齒羧酸配體和杯芳烴與過渡金屬（鋅和鈷）組裝而成，唯一不同是PCC-1為中性分子，而PCC-2是一個帶30個負電荷的陰離子分子。PCC-3是選擇了Fujita的正八面體籠，由三齒吡啶和二齒聯吡啶與鈀螯合而成，它的特點是帶有12個正電荷（圖1a）。通過X-射線單晶衍射，它們的晶體都能被清晰的解析出來（圖1b-d）。能夠精確知道分子組成和源自級別的調控，也是晶態材料的一大優勢。作者認為，通過對結構的精確調控，得到相應的“生物-納米”界面信息和作用力信息，能夠更好地認知“結構-性能”之間的關係。

由於分子籠都有空腔，這些空腔往往被用來包裹不同的客體分子。於是，作者接著研究了三種分子籠對染料和藥物分子的包裹（圖2）。由於PCC-1本身帶有熒光，不需要引入其他分子就可以研究其細胞內的傳遞路徑。作者用PCC-1包裹了一個抗癌藥——喜樹鹼（Camptothecin, CPT）。喜樹鹼是DNA拓撲異構酶抑制劑，作用機理是當細胞DNA複製時，阻止異構酶從DNA單鏈上解離下來，從而導致細胞凋亡。而PCC-2和PCC-3本身不帶熒光屬性，它們分別包裹了正電荷染料羅丹明B（Rhodamine B, RB）和中性疏水性染料尼羅紅（Nile red, NR），從而方便細胞內追蹤（圖2g）。作者使用紫外-可見光譜和熒光光譜表徵了包裹客體分子後的超分子籠（圖2e-f）。隨後，這些包裹了客體分子的超分子籠被放到用來模擬細胞內環境的PBS緩衝溶液裡，研究客體釋放的速度。從圖2h可以看到，這些超分子籠均能夠在pH值7.4附近（模擬細胞質環境）短時間內保持穩定（2-8小時），客體分子不被放出來。但隨著時間的延長，超分子籠最終會釋放大部分的客體。如果pH值降低到6.5左右（模擬內囊體和溶酶體的環境），這些超分子籠釋放客體分子的速度加快。作者認為，客體釋放是由於超分子籠的逐漸解離造成的，畢竟這些配位鍵是半穩定狀態的共價鍵。對於客體釋放時間的延遲，作者認為這有利於高通透性和滯留效應（EPR），這也是大多數納米材料載體的特性。只要在特定時間內把客體分子傳遞到相應靶向位點，之後載體即使分解也不影響，反而更容易排除體外。

圖2. 藥物包裹與釋放。圖片來源：Small

接下來，作者使用了共聚焦顯微鏡（CLSM）和熒光顯微鏡（Epi-fluorescence Microscopy），對這些超分子籠的細胞定位進行了研究（圖3）。作者首先通過共聚焦顯微鏡對比了客體分子本身與超分子籠的細胞定位的不同（圖3a）。作為小分子的抗癌藥，CPT只能在細胞質內分佈，而且由於其水溶性極低，很難進入到細胞，從而顯示出較弱的熒光信號。與之相反，PCC-1在包裹了CPT之後，主要分佈在細胞核內，並且顯示很強的熒光信號（來源於超分子籠本身）。另一方面，水溶性較好的帶有正電荷的RB染料是一個線粒體染色劑，一般會聚集到帶有負電荷的線粒體上。而RB被PCC-2包裹之後，在細胞質內呈現均勻分佈，這可能是由於超分子籠表面較高的負電荷使然。而作為一箇中性染料，NR是脂質體染色劑，一般會在細胞內顯示一顆顆球型的熒光亮點。而RB被PCC-3包裹後，顯示全部附著在細胞膜外壁上。這可能是由於PCC-3表面正電荷，更傾向於與細胞膜表面的負電荷項吸引，從而得到了截然不同的分佈。值得一提的是，這些電荷導向性的細胞器靶向作用，與之前報道的金納米顆粒的分佈規律是不同的。從藥物傳遞角度來講，超分子籠對於傳統傳遞手段是一個很好的補充。之後，作者還通過使用PCC-1包裹不同顏射的染料，研究共定位，進一步確認細胞核的靶向定位確實是PCC-1的特性（圖3b）。最後，他們還使用熒光顯微鏡，對三種不同超分子籠進入細胞的過程進行了實時影片記錄（圖3c）。

圖3.（a）客體與超分子籠的細胞定位。（b）不同顏色染料的共定位。（c）熒光顯微鏡研究細胞內傳遞。圖片來源：Small

最後，作者選擇了癌細胞（HeLa細胞），研究了三種超分子籠在抗癌方面的表現（圖4）。首先作者將三個空超分子籠與細胞培養，發現細胞存活率都很高（大於90%）（圖4a）。之前的研究很少針對含金屬的組裝體本身的細胞毒性進行研究，這個工作可以一定程度上消除一些疑惑。當然，這些金屬配位結構跟完全無毒的可溶性聚合物等材料相比還是表現了一定的細胞毒性，作者也表示更低毒的超分子籠正在繼續開發中。在這三種超分子籠都包裹了抗癌藥CPT後，繼續研究了細胞器定位跟抗癌效果的關聯。他們發現，只有能把CPT運輸到細胞核的PCC-1表現出抗癌活性的提升，其他兩種超分子籠因為沒有把藥物運送到產生藥效的位置，對抗癌活性並沒有起到任何的提升作用（圖4b）。值得一提的是，與不使用任何藥物傳遞技術相比，CPT通過PCC-1包裹和運輸藥效提升了5倍以上。

圖4. （a）超分子籠本身的細胞毒性。（b）包裹了抗癌藥的超分子籠的毒性，以及與單獨抗癌藥的對比。圖片來源：Small

——總結——

作者使用了可以調控電荷的超分子配位籠作為藥物載體，研究它們在細胞內細胞器定位以及抗癌活性的表現。這是超分子籠首次完整研究其細胞內運輸路徑，以及深入瞭解“納米-生物”界面和作用關係的工作。雖然超分子籠的生物醫學應用方面的研究還很少，但這些材料所具有的納米抗癌、藥物傳遞以及新型基因和免疫療法的潛力，使得筆者希望今後能看到越來越多這方面的研究。同時，也期待這些新型藥物載體能真正運用到臨床抗腫瘤的研究上來。

原文

Investigating Subcellular Compartment Targeting Effect of Porous Coordination Cages for Enhancing Cancer Nanotherapy

Yu Fang, Xizhen Lian, Yanyan Huang, Guo Fu, Zhifeng Xiao, Qi Wang, Beiyan Nan, Jean-Philippe Pellois, Hong-Cai Zhou

Small, 2018, DOI: 10.1002/smll.201802709

導師介紹

周宏才

http://www.x-mol.com/university/faculty/50101

Jean-Phillippe Pellois

http://www.x-mol.com/university/faculty/50102

（本文由

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