以蛋白质的结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。而大肠杆菌的原核表达，由于操作简单、表达量高、成本较低等优点，是运用最广的蛋白表达方法。这里，小知了就大肠杆菌原核表达的整体思路做一个简单的介绍。

原核表达的整体思路

一. 确定表达策略

在做表达之前，我们首先要确定表达策略。这主要涉及三部分：

1. 目的基因从哪里来：从NCBI上找到目的基因的序列后，我们首先要对基因的序列和来源物种进行分析，确定其密码子偏好性和翻译蛋白的定位。再就是想办法拿到目的基因，确定是基因合成还是提基因组或者RNA做模板；

大肠杆菌密码子使用分析：

http://faculty.ucr.edu/~mmaduro/codonusage/usage.htm

2. 表达载体的选择： 原核表达有很多，像用的比较多的pET系列，以MBP为融合蛋白的pMAL系列，以GST为融合蛋白的pGEX系列等。选择表达载体一方面要考虑目的蛋白的性质，选择合适的载体骨架（表达调控元件，拷贝数等）和融合蛋白；另一方面还要考虑后续的纯化情况，是否具有易于纯化的标签等（如：6His 、MBP等）。

（部分常见原核表达载体）

3. 表达菌株的选择： 目前使用的比较多的应该是BL21（DE3），但是不同菌株之间还是有差别的。如针对稀有密码密码子的Rosetta系列，针对泄露表达和蛋白毒性的pLysS/E菌株，针对较多二硫键的Origami菌株，等等。这里我就不放列表了，大家具体可以参考pET manual。

二. 获得目的基因

在目的基因来源物种容易获得的情况下，一般是对其进行基因组（或总RNA）进行提取，再通过PCR或者RT-PCR的方法扩增得到目的基因。来源物种不容易获得时，可以根据目的基因序列优化后合成基因。

1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

三. 构建重组表达载体

构建载体的最常用的方法是酶切/酶连。现在很多公司都推出重组试剂盒，让构建载体变的更加简单，成本也在慢慢降低。这里主要介绍一下酶切酶连的方法：

1. 载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。

2. PCR产物双酶切后回收，在T4-DNA连接酶作用下连接入载体。

酶切酶连示意图

连入载体后就是转化、筛选和测序，之前推过，这里附上链接，不再赘述。

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四. 转化表达菌株，进行小量表达

经过测序，确定构建的载体正确就可以转入表达菌株里了。

在可以通过挑取几个单克隆进行小量表达，用SDS-PAGE（或Western Blot）对表达情况进行分析。

确定表达了之后再选取表达量最好的单克隆进行条件优化。可以优化的参数有：诱导时机、诱导剂的量、诱导时间、培养温度等。

如果没有表达，那需要我们仔细的对实验进行分析，找到问题的所在并解决问题，常见的引起不表达的原因有：蛋白毒性，本底表达等。我们要根据出现的问题及时调整表达策略。

五. 大量表达

到这一步已经很不容易了，所以更加不能掉以轻心。

小量表达优化后，我们要对表达量和表达条件有了一个大概的了解。根据需要的蛋白量，我们按优化好的条件进行大量表达。为了让实验有重复性，要进行严格放大。

表达后收集的菌体，用预冷的PBS清洗。如果不是马上纯化，建议用液氮冷冻后放-80℃保存。

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