08.17 中國動物檢疫｜我國首例非洲豬瘟的確診（全文）

我國首例非洲豬瘟的確診

王清華 1，任煒傑 1，包靜月 1，戈勝強 1，李金明 1，李 林 1，樊曉旭 1，劉春菊 1，王 華 1，永強 1，徐天剛 1，吳曉東 1，段亞良 2，顧貴波 2，周晨陽 2

（1. 中國動物衛生與流行病學中心，國家外來動物疫病研究中心，山東青島 266032；2. 遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧瀋陽 110164）

摘 要 ：近日，遼寧省瀋陽市一養豬戶飼養的豬陸續發生不明原因死亡，病死豬剖檢發現脾臟異常腫大，疑似非洲豬瘟病毒感染。經國家外來動物疫病研究中心檢測，確診為非洲豬瘟病毒核酸陽性，B646L/p72 基因序列417 個鹼基與俄羅斯毒株 100% 匹配，與俄羅斯和東歐目前流行的格魯吉亞毒株（Georgia 2007）屬於同一進化分支。這是我國發現的首例非洲豬瘟，疫情來源有待進一步調查。關鍵詞 ：非洲豬瘟 ；非洲豬瘟病毒 ；熒光定量 PCR ；普通 PCR ；ASFV 特異性抗體中圖分類號 ：S852.65 文獻標識碼 ：A

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）引起豬的一種急性、熱性、高度接觸性動物傳染病， 臨床上以高熱、網狀內皮系統出血和高死亡率為特徵，易感豬群的病死率高達 100%。鑑於該病的嚴重危害性，世界動物衛生組織（OIE）將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。ASFV 不感染人，對人的健康不構成威脅。目前， 針對 ASF 防控，尚無有效的商品化疫苗。

2018 年 8 月 1 日，國家外來動物疫病研究中心接到遼寧省瀋陽市沈北區發現 ASF 臨床可疑病例的報告（圖 1）。截至 8 月 1 日，發病豬場累計死亡 47 頭，對剛病死的 2 頭豬剖檢發現：脾臟極度腫大，嚴重梗死，質脆易碎，其中一頭豬脾腫大至少 10 倍，一頭豬脾腫大 5~7 倍；肺出血、質硬，有間質性肺炎變化；下頜淋巴結、腸繫膜淋巴結出血，切面呈大理石樣變；胃漿膜面瀰漫性出血；腎腫脹明顯、色淡，未見出血點；扁桃體見陳舊性出血，符合 ASF 症狀。國家外來動物疫病研究中心立即開展病原學檢測，證實本次疫情由ASFV 引起。這是我國曆史上的首次 ASF 發病記錄。

圖 1 發病場地理位置

1 材料與方法

1.1 病料

病原學樣品：分別來源於 2 頭病死豬的剖檢病料，包括全血、脾臟、淋巴結、扁桃體；30 頭臨床健康豬的全血。

血清樣品：2 頭病死豬及同群 30 頭臨床健康豬血清。

1.2 病料 DNA 提取

在加有陶珠的組織勻漿管（Roche）中，加入600 µL PBS 緩衝液，再加入剪碎的組織樣品約 30mg，使用 HyBaid RiboLyser 組織勻漿機進行勻漿處理。取 200 µL 組織勻漿液和全血，分別使用病毒 DNA 提取試劑盒提取 DNA。最後將提取的核酸於 −80 ℃冰箱中保存備用。

1.3 熒光定量 PCR

依據文獻報道 [1]，用本實驗室建立的 OIE 推薦的 ASFV 特異的熒光定量 PCR 方法進行 ASFVp72 基因片段的擴增。ASFV 特異性引物為 king-s/ king-a，TaqMan 探針為 ASFVP，同時以本試驗室合成的質粒 DNA 標準品為陽性對照。

1.4 普通 PCR

依據文獻報道 [2]，用本實驗室建立的 OIE 推薦的 ASFV 特異的 PCR 方法進行 ASFV p72 基因片段的擴增。ASFV 特異性引物為 PPA1/PPA2，產物長度為 257 bp，同時以本試驗室合成的質粒DNA 標準品為陽性對照。

1.5 測序片段 PCR 擴增

依據文獻報道 [3-4]，合成擴增 p72 基因分型的通用型引物（p72-D/p72-U）。引物由上海生工生物技術有限公司合成。採用高保真的Phusion High- Fidelity PCR Master Mix 擴增B646L/p72 基因片段， 預期擴增片段大小 478 bp。50 μL 的 PCR 反應體系 為 ：2X Phusion Master Mix 25 µL，p72-D（10μmol/L） 和 p72-U（10 μmol/L） 各 2 µL， 模 板DNA 2 μL，用滅菌水補齊體積至 50 μL。PCR 反應程序為：98 ℃預變性 30 s；然後進行 35 個 PCR 循環（98 ℃ 10 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）；最後 72℃ 10 min。

1.6 PCR 產物測定

擴增產物使用 1% 的瓊脂糖凝膠電泳，然後切膠回收， 對回收的 DNA 直接用於測序。序列 拼 接 採 用 Lasergene 7.1 軟 件（DNASTAR Inc.Madison，WI，USA） 中 的 EditSeq 與 MegAlign 模塊。多序列的比對和遺傳進化樹的繪製，應用MEGA 5.0 軟件進行。其他國家的參考毒株序列從GenBank 中獲得。

1.7 抗體檢測

西班牙 INGENASA 公司生產的非洲豬瘟阻斷 ELISA 抗體檢測試劑盒，批號為 050218。法國ID-vet 公司生產的非洲豬瘟間接 ELISA 抗體檢測試劑盒，批號為 B71。國家外來動物疫病研究中心自主研發的非洲豬瘟間接 ELISA 試劑盒，批號為 201801。INGENASA 公司生產的非洲豬瘟阻斷ELISA 試劑盒包被抗原為 p72 蛋白，IDvet 公司生產的非洲豬瘟間接ELISA 試劑盒包被抗原為p30、p62、p72 重組蛋白， 自主研發的非洲豬瘟間接ELISA 試劑盒包被抗原為 p30 蛋白。

2 結果

2.1 熒光定量 PCR

熒光定量 PCR 檢測結果顯示，採自 2 只病死豬的 8 份組織樣品和全血中都能檢測到ASFV 特異性擴增曲線，Ct 值為 19.14~26.5（圖 2）。

圖 2 實時定量 PCR 擴增結果

擴增曲線的橫座標為擴增循環數，縱座標為熒光強度；綠色橫線位置為熒光強度的閾值，對應的循環數為臨界循環數（CT）；CT 值低於 40 判定為陽性；圖中擴增曲線從左至右依次為P、全血 1、脾 1、全血 2、淋巴結 2、腎 2、淋巴結 1、腎 1、脾 2

2.2普通 PCR

ASFV 普通PCR 擴增結果顯示，7 個樣本（分別為全血 1、淋巴結 1、腎 1、脾 1、全血 2、淋巴結 2、腎 2）在 257 bp 左右有特異性擴增條帶，與陽性對照一致（圖 3）。樣本脾 2 特異性擴增條帶較弱。

圖 3 普通 PCR 檢測結果

1~8. 全血 1、淋巴結 1、腎 1、脾 1、全血 2、淋巴結 2、腎 2、脾2；P. 陽性對照；N. 陰性對照；M. 分子量標記（由上至下分別為2000、1000、750、500、250、100 bp

2.3 p72 基因片段序列遺傳進化分析

對樣本 B646L/p72 基因片段普通 PCR 產物進行正反向測序，對得到的序列進行拼接後獲得 p72基因片斷序列，長度為 417 bp（圖 4）。對擴增的P72 基因序列，應用鄰接法（Neighbor-joining）繪製了遺傳發生樹（圖 5）。結果顯示，該樣本病毒屬於基因 II 型，與目前在俄羅斯和東歐流行的格魯吉亞毒株（Georgia 2007）同屬於一個進化分支。

2.4 抗體檢測

對 32 份血清樣品的 ASFV 特異性抗體檢測結果均為陰性。

圖 4 樣本 p72 基因片段測序結果

圖 5 P72 基因遺傳進化分析

3 討論

ASFV 是非洲豬瘟病毒科（Asfarviridae） 非洲豬瘟病毒屬的唯一成員， 基因組為雙股線狀DNA，大小為 170~190 kb。根據病毒編碼主要衣殼蛋白 p72 的 B646L 基因，可將該病分為 24 個與地域性相關的基因型 [5-6]。基因 II 型流行於非洲東南部，2007 年傳至格魯吉亞，並擴散到俄羅斯聯邦和東歐地區 [7]，已在高加索地區定殖；2017 年，該基因型病毒向東長距離跨越式傳播至俄羅斯遠東地區伊爾庫茨克 [9]，導致傳入我國的風險空前升高。目前，ASF 已經成為困擾歐洲養豬業的一個重要問題 [8]。該病跨國界傳播能力和危害性使其成為全球性的問題。

本次疫情是我國確診的首例非洲豬瘟。該豬場生物安全條件較差，緊臨車輛繁忙的鄉間公路， 場區出入口無消毒池。病死豬在當地獸醫部門監督下就近掩埋處理，有相應的生豬保險理賠記錄。剩餘存欄生豬 336 頭，臨床未見異常。據瞭解，死亡豬多為 100 kg 的大豬。p72 基因片段遺傳進化分析顯示，本次暴發流行的毒株為基因 II 型，與俄羅斯及東歐流行的毒株屬同一分支，提示疫情可能來自俄羅斯和東歐疫情國家。為進一步確定病毒與俄羅斯和東歐流行株的差異，正在對全基因組序列進行分析。值得注意的是，該起疫情的病死率雖然很高（100%），但發病率和死亡率較低，發病高峰期 10 頭左右，平常日均死亡 3 頭左右。此外，同群豬臨床健康，隨機採集 30 頭豬的抗凝血、血清樣品的病原學檢測結果和血清學檢測結果均為陰性，提示該起疫情毒株的群內傳播能力或有一定侷限性。

感染生豬及其產品的移動是導致疫情快速遠距離傳播的主要途徑。尤其值得注意的是，ASFV 在未經高溫處理的肉品中存活能力很強，未經高溫處理的泔水、煙燻肉、風乾肉、醃肉、火腿等也是造成病毒跨區域傳播的重要因素。歷史上，多起跨境傳播的 ASF 疫情與航空器、列車運載上述豬肉製品的處理不當、感染ASF 野豬移動有關[10]。目前， 應加強流行病學調查和主動監測排查工作，特別對病死豬的檢測，應重點關注屠宰場、病死生豬無害化處理場等高風險場點，對已發現的確診病例要做進一步追溯排查；加大科普宣傳，發動養豬戶、診療人員和相關從業人員主動上報可疑情況。若發生疫情，應嚴格按照《非洲豬瘟疫情應急預案》和《非洲豬瘟防治技術規範》進行處置。

致謝：

中國動物衛生與流行病學中心王志亮總獸醫師在疫情調查和檢測分析過程中給予悉心指導，遼寧省動物疫病預防控制中心積極協助調查並提供樣品。

參考文獻：

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