質粒DNA的分離、純化和鑑定

　　在製作酶譜、測定序列、製備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質粒DNA,為此需要大量提取質粒DNA。大量提取的質粒DNA一般需進一步純化,常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。
　　（一）、鹼法
　　1、取培養至對數生長後期的含pBS質粒的細菌培養液250ml，4℃下5000g離心15分鐘,棄上清,將離心管倒置使上清液全部流盡。
　　2、將細菌沉澱重新懸浮於50ml用冰預冷的STE中（此步可省略）。
　　3、同步驟1方法離心以收集細菌細胞。
　　4、將細菌沉澱物重新懸浮於5ml溶液I中,充分懸浮菌體細胞。
　　5、加入12ml新配製的溶液II, 蓋緊瓶蓋,緩緩地顛倒離心管數次,以充分混勻內容物,冰浴10分鐘。
　　6、加9ml用冰預冷的溶液III, 搖動離心管數次以混勻內容物,冰上放置15分鐘,此時應形成白色絮狀沉澱。
　　7、4℃下5000g離心15分鐘。
　　8、取上清液,加入50ml RNA酶A(10mg/ml), 37℃水浴20分鐘。
　　9、加入等體積的飽和酚/氯仿,振盪混勻,4℃下12000g離心10分鐘。
　　10、取上層水相, 加入等體積氯仿,振盪混勻,4℃下12000g離心10分鐘。
　　11、取上層水相,加入1/5體積的4mol/L NaCl和10% PEG(分子量6000), 冰上放置60分鐘。

　　12、4℃下12000g離心15分鐘, 沉澱用數ml 70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鐘。
　　13、真空抽乾沉澱，溶於500ml TE或水中。
　　[注意] 1. 提取過程中應儘量保持低溫。
　　2. 加入溶液II和溶液III後操作應混和,切忌劇烈振盪。
　　3. 由於RNA酶A中常存在有DNA酶,利用RNA酶耐熱的特性,使用時應先對該酶液進行熱處理(80℃1小時),使DNA酶失活。

　　（二）、Wazard大量DNA純化系統
　　鹼法大量提取DNA往往需要很長的時間.Promega公司的Wiazrd大量DNA純化系統既簡單又快速,只需要離心和真空抽乾,這個系統可以從500ml培養液中在3小時以內獲得1mg以上的高質量的質粒DNA(200-20000bp)。該系統不需要酚和氯仿抽提,純化後的DNA溶於水或TE緩衝液中，不含任何鹽份，可以直接用於DNA序列分析和酶切反應，也可以用於在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進行體外轉錄反應等。
該系統中含有的試劑和柱子可以用於10次100-500ml質粒培養液的分離和純化,試劑包括: 150ml 細胞懸浮液，150ml 細胞裂解液，150ml 中和液，100ml Wizard 大量DNA純化樹脂，125ml Wizard柱子洗脫溶液和10支Wizard帶有存儲離心管的柱子。
　　1、100-500ml細胞培養液置離心管中, 22-25℃下5000g離心10分鐘, 所得細胞沉澱充分懸浮於細胞懸浮液中。
　　2、加15ml細胞裂解溶液並輕輕混合,可以反覆倒置混合,但不能用渦旋振盪,細胞裂解完全時,溶液會變清,這一步需要20分鐘。
　　3、加15ml中和溶液,立即反覆倒置離心管數次，並使之混勻。
　　4、14000g,22-25℃離心15分鐘。
　　5、小心地將上清液吸出並移至一個新離心管中。
　　6、加0.5倍體積的異丙醇,混合均勻, 14000g 22-25℃下離心15分鐘。

　　7、棄上清,懸浮DNA沉澱於2ml TE緩衝液中。這一步中也許有的沉澱不能溶解。
　　8、加10ml Wizard大量DNA純化樹脂溶液, 並渦旋混合。
　　9、每一個樣品,使用一支Wizard大量柱子,柱子的頭插在真空器上(Promega產品,與此配套)。
　　10、將樹脂/DNA混合液轉入柱子中,真空抽取樹脂/DNA混合液。
　　11、將樹脂/DNA混合液抽乾後,加13ml柱子洗脫溶液至離心管中, 對管底部的樹脂/DNA進行洗脫(柱子一邊旋轉一邊加入洗脫液)，並加入柱子中。
　　12、真空抽乾所加入的洗脫。
　　13、再加12ml柱子洗脫液進柱子並抽乾。
　　14、加入5ml 80％乙醇漂洗柱中的樹脂, 柱子真空抽乾後將柱子放入用戶提供的離心管中,2500rpm(1300g)離心5分鐘。
　　15、取出柱子，真空抽乾5分鐘,再將柱子放入系統中所提供的離心管中，2500rpm(1300g)離心5分鐘。
　　16、在柱子中加入1.5ml 65-70℃預熱過的滅菌重蒸水或TE,1分鐘後2500rpm(1300g)離心柱子/離心管5分鐘。
　　17、取出柱子,離心管中溶液即為提取的質粒DNA,可以直接放在離心管中,蓋上蓋子，儲存在4℃或-20℃備用。
　　[注意] 1. 在使用之前,系統所提供的柱子洗脫液按1:1加入125ml 95％乙醇。
　　 2. 純化樹脂必須混勻後再用.

　　（三）、Sephrose 2B柱純化質粒DNA
　　鹼法提取的質粒DNA即使用RNA酶處理,仍會含有少量RNA。當有些試驗需無RNA汙染的DNA製品時,則需進行進一步純化。一般常用Sepharose 2B或Sepharose 4B進行純化,該方法具有快速,條件溫和,重複性好,載體物質可以再利用等優點,因而已廣泛用於質粒DNA純化。
　　1、將Sepharose 2B經含0.1% SDS的TE（pH8.0）平衡後上柱。
　　2、將至多1ml的DNA溶液鋪在Sepharase 2B柱上。
　　3、待DNA溶液完全進入柱內後立即在柱的上部連接含有0.1% SDS的TE(pH8.0)貯液瓶。

　　4、以1ml流出液為1份進行收集。
　　5、對每一管測定其OD260值,以確定哪些管中含有質粒DNA。通常質粒DNA在柱上流出的第一個峰中。
　　6、合併所有含質粒的洗脫液,用等體積的酚/氯仿(1:1)抽提,4℃下12000g離心2分鐘,將上層水相轉入新管。
　　7、加入2倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃下沉澱10分鐘,然後4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。
　　8、沉澱加70%乙醇洗滌,4℃下12000g離心10分鐘,棄去上清液。
　　9、沉澱真空抽乾,重新溶於TE或無菌水中。

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