核酸檢測在生物安全防控和定點清除中的作用毋庸置疑。部分養殖集團已經建立了由中心實驗室、區域實驗室和快檢實驗室為基礎的非瘟檢測響應體系。部分規模化豬場也配備了熒光定量PCR檢測儀等設備，開展外圍生物安全的監測，在定點清除中通過在豬場內的快速檢測也滿足了對檢測時限的要求。但筆者通過考察發現，檢測體系與養殖一線的協同仍剛剛起步，缺少科學合理的採樣方案，突出的表現是過度檢測導致耗費檢測資源，並可能降低檢測結果的可靠性。
一、過度檢測產生的問題
常見問題一：
平時風平浪靜，樣品量少，實驗室檢測結果相對準確。一有風吹草動，生產體系即開始全群採樣排查。檢測人員加班加點對樣本進行檢測，一段時間內有可能出現多份樣本可疑。對可疑樣本換試劑盒複檢，樣品結果可能又呈陰性。
主要原因有：
（1）沒有根據統計學規律、豬群分佈特點和疾病傳播特點制定採樣方案，導致樣本量過大，檢測量超出了實驗室的承載能力；
（2）實驗室中缺少清除氣溶膠的環境控制設施，陽性對照或陽性樣本由於PCR管材密封不嚴或操作中的交叉汙染，逸出氣溶膠導致汙染後續樣本，尤其是在針對超出承載能力的樣本量時，更易產生失誤。
常見問題二：
生產體系以周為節律，對豬群進行篩檢，以求在非洲豬瘟潛伏期內第一時間發現病原。由此產生大量樣品，採樣和檢測人員多班倒。豬場一旦真正發病，往往多點發病。
主要原因有：
沒有根據風險級別制定對應的採樣方案，“體檢”的頻率過高，採樣工作強度大，在採樣過程中生物安全工作容易執行不到位，一旦真出現感染源，採樣過程可能也是散毒過程。
二、如何科學採樣，讓資源合理配置？
（1）明確責任主體，負責檢測方案的制定和與檢測中心的協調
檢測工作應由瞭解豬場豬舍實際情況的獸醫（生產管理型獸醫）發起，並由檢測中心負責人根據樣品檢出情況與駐場獸醫共同制定下一階段的採樣方案。明確責任主體讓專業的人負責制定檢測方案，不但可以保證檢測結果更加可靠，也能通過樣本的科學分佈確定最小的排查範圍，這是節省人力、物力，發揮檢測最大效能的前提。
（2）監測有側重點，制定不同場景下的監測與檢測預案
監測和檢測的頻率與風險等級密切相關，需根據風險等級建立檢測聯動機制。
1）在風險等級較低時，日常監測的重點應是車輛、人員、物資等來自外部的威脅。可定期對豬場周邊的環境進行定期的排查，如在春節期間，針對周邊有殺“年豬”的情況出現時，需要對環境進行採樣檢測，對進出豬場的車輛、物資和人員自然也要加大檢測的強度。當週邊出現死豬時，需要對地表水進行檢測；
2）當週邊環境中人流、物流、車流中檢出頻次增加時，表明豬場面臨的風險在增強。除增加消毒頻次外，此時可加大對豬場內環境的檢測。可對人員、粉塵、水源、道路、汙水池、工具、衣物等區域增加檢測頻次，以督促生物安全制度的落實，通過檢測也能掌握豬場的風險點，並能及早制定對風險點的預案；
3）全群性排查工作不宜過頻，應以異常豬的日常監測為主。豬越來越金貴，豬場希望通過逐頭檢測儘可能減少冤殺豬的想法無可厚非。但有些豬場以7天為節律進行豬群排查，採樣多，隨之而來會造成檢測任務重，檢測過程中難免出現交叉汙染等問題。
對於豬群普查的啟動要以豬場的風險等級，豬群健康狀況為參考依據，如當在外圍出現多起車輛或人員檢出陽性時或進出人員頻次較大時，獸醫團隊可以針對豬群進行排查，輔助以豬欄、料槽等環境樣本以便排查地更為徹底。隨著非瘟潛伏期的延長，除了核酸檢測外還可以結合抗體監測進行普查，抗體監測可每年監測2～3次；
4）對豬群尤其針對異常豬的日常監測，要常抓不懈。規模化豬場往往從妊娠母豬開始發病，針對妊娠母豬，只要發現剩料的，就要立即進行唾液或鼻拭子採樣檢測。針對育肥豬中的異常豬，出現精神狀態不佳、拱料不食、喜臥的豬可通過唾液、鼻腔液或直腸拭子進行採樣確診。
（3）啟動定點清除前先確定感染範圍，可減少樣本量
大多數豬場進行定點清除時，往往先對豬逐頭檢測後再對感染豬進行清除，這種操作方法在時間上滯後，人員操作存在交叉傳播的風險。可先根據豬場豬舍分佈，以單元格模式在各區域對異常豬和環境進行採樣，先確定風險的區域後在此區域內再篩查，定點清除效率會更高。建議採取以下步驟進行操作：
1）發現陽性豬後，先按預定的清除路線將發病豬移出豬舍。剔除過程中可對剔除的每頭豬進行採樣，檢測感染比例和病毒載量（此數據可作為對周邊豬群處理或監測的依據）；
2）對送檢不便的豬場，確診後可以依據臨床症狀對易感豬和疑似豬進行淘汰（而不是等待檢測結果出來再淘汰，以免延誤戰機）。在對減料不食的豬剔除過程中仍需對其進行採樣，此數據可作為後續淘汰力度的依據；
3）以檢出的陽性的豬欄為圓心，對周邊欄的通道和欄杆進行環境檢測，對區域內的異常豬隻進行採樣檢測，從而確定有幾棟豬舍發病和可能感染的危險區。對人員交叉情況進行分析，確定需監控的區域。在監控區內開展兩個潛伏期的監測與排查，以相對靜默的方式進行排查，減少豬群的應激；
4）在對風險區內豬隻進行剔除時，按時間軸線繪製不同時間點的病毒載量和檢出率的變化趨勢，以便評價疫情控制的效果，從而及時調整消毒和管理方案；
5）豬群在兩個潛伏期內未出現新的陽性個體後，仍需持續對環境樣本（尤其是汙水池等區域）監測一個月，以監督生物安全措施的落實，徹底清除豬場內的病原。
三、如何使檢測結果更加可靠？
（1）採樣流程培訓和相關裝備的配備是結果可靠的前提
除需對一線操作人員進行採樣流程SOP培訓之外，還需配備必要的採樣工具、消毒和防護措施，從而降低交叉汙染的概率。對於樣本的保存可配置相關工具，例如唾液樣本容易被降解，可配備冰盒、樣品保存液、運輸時配備專用的保溫箱，都是保證結果可靠性的前提。採樣過程中最好設置雙人，專人記錄、互相監督，保證採樣的正確和信息的準確；
（2）以可靠樣本進行確診是啟動定點清除的核心
確診仍是第一要務，在此筆者並不是否認唾液或鼻拭子在提前發現傳染源中的價值，但僅僅根據唾液或鼻拭子核酸呈弱陽性就啟動定點清除或呈陰性就排除感染風險，筆者認為都是有待商榷的。因為無論是在採樣過程還是檢測環節，都存在誤診的可能，唾液或鼻拭子樣本病原丰度不高在採樣和運輸過程中降解也是導致其不可靠的原因之一。
在豬場首次出現唾液或鼻拭子核酸陽性結果時，本著寧可信其有的觀點，可以先對豬隻進行隔離，並在2～3天后對這些豬隻採集血拭子複查。採用血拭子檢測的風險性相對較小，一方面非洲豬瘟感染早期不會出現凝血不良；另一方面，血拭子採集的方法出血量是可控的，不會造成大面積汙染。病毒在血拭子中受外界干擾少、病毒載量高、更可靠；需要在隔離期內對豬舍做好相應的消毒措施；
（3）養殖集團應建設標準化的中心實驗室
熒光定量PCR非常敏感，容易受到氣溶膠的汙染，可靠的硬件設施是結果準確的保障。養殖集團可參照2010年農業部頒佈的《獸醫實驗室生物安全要求通則》的要求建設實驗室，其中PCR實驗室應該由四分區組成，四分區有獨立通風和空調系統，設定緩衝區和氣壓流向更有助於降低實驗室上游汙染的概率。養殖集團的中心實驗室可作為仲裁機構，對結果進行最終的確認，並開展對體系內的區域實驗室的盲評，有以便於建立更可靠的檢測系統；
（4）區域實驗室可通過改造通風設施降低氣溶膠汙染
1）實驗室設計按試劑配製區、樣本製備區、PCR擴增區進行物理性分區，每個區域都要保障獨立通風，對於PCR擴增區更需要設置大功率排風扇不間斷的將氣溶膠排出試驗區域；
2）加樣和試劑配製需在生物安全櫃裡完成（非超淨工作臺，超淨工作臺仍然是氣體內循環的，不能有效清除氣溶膠），如沒有生物安全櫃，通風櫥是高性價比的解決方式；
3）下班後實驗室需保持密閉狀態，需關閉排風扇，打開紫外燈，以消除環境核酸汙染；
4）實驗室內需定期消毒，除用紫外線照射外，可用氯製劑如84消毒液去除試驗檯和地面的核酸汙染；
5）移液器、離心機均可用稀釋後濃度為30%的84消毒液擦拭，但在消毒後需用清水反覆擦洗乾淨；
6）選擇有內參的檢測試劑，通過內參曲線可監控實驗操作人員的操作是否規範。此外內參的Ct值及曲線可反饋PCR反應的效率，可降低由於樣本抑制PCR反應但被誤判為陰性的可能。
7）實驗室需準備2～3種試劑盒，一旦疑似假陽性時，可先用另一種試劑進行復核，如另一種試劑盒檢測為陰性，極有可能是存在PCR產物的氣溶膠汙染。需從硬件設施，操作、耗材（如PCR管是否密閉性良好）等方面找到汙染的原因。
四、小結
過度檢測是對檢測資源的浪費，日常監測應重點在外圍監測和對異常豬的確診上。即使是在緊急情況下，也需要專業人員在充分了解豬場現狀的前提下，根據統計學制定相應的檢測方案，合理的採樣發揮檢測的效能。
為了保證檢測結果的可靠，獸醫應加大對基層採樣人員的採樣流程培訓和監督考核，讓生產體系和檢測體系形成合力。在硬件設施上，建設標準化PCR實驗室是降低汙染的基礎，養殖集團需要建設高標準的中心實驗室作為終評機構。
相信在2020年我們必然在非洲豬瘟防控體系上更上一層樓，養殖集團會以檢測數據為基礎，更為合理地進行風險預警與豬群排查，在定點清除中的方案會更精準、更有效、損失最小，這需要檢測中心將數據統計和臨床工作相銜接，這更需要兩個體系深度的融合。堅信中國養殖人的聰明才智和不懈努力，最終能戰勝非洲豬瘟。
專家點評
自非洲豬瘟傳入國內後，我們很多豬場逐漸意識到檢測和監測的重要性，並陸續建立了各自的檢測實驗室。基於對非洲豬瘟傳入風險的分析，我們對關鍵風險點進行監控是非常有必要的。在具體的工作中，我們需要注意以下三點：第一、強化針對非洲豬瘟的生物安全流程設計，注重清洗、消毒效果的評估。檢測、監測是為了及時發現可能存在的風險，逐步優化和改善工作流程，建立科學合理的標準操作程序。一旦流程建立，就可以採用編組抽查的方式進行採樣和檢測，避免過度檢測而造成實驗室超負荷運轉、檢測人員打疲勞戰。第二、實驗室的檢測結果是疫病診斷的一種重要的參考，但不是唯一的依據，還需要結合生產實踐、流行病學調查、臨床表現、病理病變等進行綜合判斷。第三、 我們要充分認識實驗室檢測的侷限性。檢測結果經常會受到臨床採樣、樣品的運輸保存、檢測方法、操作過程、實驗室佈局等方面的影響，可能出現假陽性或假陰性的結果。
本文作者陳家鋥博士結合其臨床抗非經驗，提出“過度檢測，適得其反——檢測在非洲豬瘟防控中的科學應用”。首先，他強調要依據統計學規律，根據豬群分佈特點和疾病傳播特點制定科學的採樣方案，並關注環境汙染（如氣溶膠）。不恰當的過度檢測會導致檢測效率降低，時間、金錢投入多，導致檢測結果的錯誤。其次，他提出如何科學採樣、合理配置資源，不僅“授之以魚，還能授之以漁”。最後，針對實驗室檢測，提出關注採樣流程、設備配置、疫病診斷、實驗室標準化和氣溶膠汙染等方面，以提高檢測結果的可靠性。希望大家儘可能做到精準檢測、持續提升、管控風險、助力抗非。
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