原始態（Naïve state）多能性相關研究是近年來幹細胞及重編程領域的研究熱點和難點，與傳統的primed狀態相比，Naïve態捕獲了體內植入前胚胎髮育的階段，具有更強的可塑性，在早期胚胎髮育研究及未來臨床應用中具有更廣闊的前景。在近10年的研究中，科學家們取得了一系列重要進展，已建立了較為穩定的人naïve 態多能幹細胞的培養和誘導條件【1,2】，並通過抗體庫篩選，發現了一系列能夠用來分離、指徵和鑑定naïve態多能幹細胞及中間細胞群體的特定細胞表面蛋白【3】，為naïve態多能幹細胞的純化、分離以及naïve態誘導和培養體系的進一步優化提供重要基礎。然而，目前所鑑定的表面抗原多在 naïve 態建立及維持過程中不發揮重要功能，而其在該過程中的動態及發生的分子機制也仍不清楚。
2020年3月17日，同濟大學高紹榮教授團隊在Cell Reports發表題為“Identification of ALPPL2 as a naïve pluripotent state-specific surface protein essential for human naïve pluripotency regulation”的研究論文，首次鑑定出特異指徵人類naïve態多能性的功能性表面分子標誌物ALPPL2蛋白，並揭示了其在人naïve態多能幹細胞的建立和維持中的重要作用機制。
研究人員以系統比較人naïve態及primed態誘導多能幹細胞的全部膜蛋白表達差異為基礎，運用iTRAQ-MASS定量技術及組學分析技術，鑑定出naïve態多能性特異表面分子候選庫。結合naïve／primed態胚胎幹細胞膜蛋白的MASS定性分析結果，確定ALPPL2蛋白作為研究重點。利用免疫熒光染色，研究人員分別檢測培養在不同培養體系（5iLAF 或t2iLGÖ6983）下的naïve多能幹細胞、人植入前早期胚胎及體細胞naïve重編程晚期細胞，進一步證實了ALPLL2的明顯膜定位以及在naïve態細胞中的特異高表達。
同時，結合公共naïve／primed多能幹細胞轉錄組數據、體細胞naïve／primed重編程轉錄組數據、人早期胚胎髮育轉錄組數據，也發現ALPPL2特異地高表達於naïve態細胞中。從而在蛋白水平和轉錄組水平上分別驗證了ALPPL2作為naïve態多能幹細胞表面標誌物分子的特異性和準確性。此外，在naïve態體細胞重編程、naïve-primed多能性狀態轉化等多種系統中，利用ALPPL2啟動子驅動的報告系統可特異且準確地指徵naïve態多能性的建立或退出，進一步驗證了該分子對naïve態多能性特異的指徵作用。
進一步的研究發現，利用CRISPR/Cas9系統敲除ALPPL2基因會導致naïve態多能性無法正常維持，具體表現為naïve態多能幹細胞克隆的形態塌陷，報告系統熒光信號衰減以及naïve態多能性基因STAT3和TFCP2L1等顯著下調；此外ALPPL2敲除的體細胞也不能正常的完成naïve態重編程，而對primed態細胞以及primed態重編程則沒有明顯影響，說明ALPPL2在naïve態多能幹細胞的建立和維持中都發揮著重要作用。對此，研究者通過IP和co-IP蛋白互作實驗發現了ALPPL2能夠與IGF2BP1這一RNA結合蛋白髮生緊密的相互作用，並且在naïve態細胞中敲除IGF2BP1的表型和轉錄譜都與ALPPL2 敲除十分相似，這些實驗結果說明IGF2BP1可能是ALPPL2基因發揮作用的下游靶點。此前有研究結果表明IGF2BP1能夠識別並結合某些特定的mRNA分子繼而調節他們的穩定性和表達水平【4】。
緊接著，作者通過RNA免疫共沉澱技術（RIP）發現IGF2BP1能夠特異識別並結合naïve態關鍵多能性因子STAT3和TFCP2L1 mRNA，穩定其表達。而外源過表達STAT3和TFCP2L1能夠一定程度上的恢復ALPPL2或IGF2BP1敲除對naïve態多能幹細胞的影響。研究人員還在敲除ALPPL2的naïve態細胞中分別過表達正常的IGF2BP1蛋白和點突變導致功能失活的IGF2BP1蛋白。實驗結果發現，正常表達的IGF2BP1也能夠一定程度上恢復ALPPL2敲除對naïve態多能幹細胞的影響，而失活的IGF2BP1則對ALPPL2敲除後的細胞表型沒有明顯改變。
綜上，這一研究鑑定了能特異性指徵人類naïve態多能性的首個功能性表面分子標誌物ALPPL2蛋白，並通過其功能機機制研究，深化了對naïve態多能性建立及維持的分子機制的理解，為naïve態建立過程中細胞命運決定機制及naïve態多能性誘導培養體系的優化等後續研究提供基礎。
據悉，同濟大學高紹榮課題組的直博生畢焱、塗志奮為本文章的共同第一作者；高紹榮教授、王譯萱教授為本文的共同通訊作者。
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https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.02.090
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參考文獻
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3.Collier, A. J. et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell 20, 874-890 e877, doi:10.1016/j.stem.2017.02.014 (2017).
4.Huang, H. et al. Recognition of RNA N(6)-methyladenosine by IGF2BP proteins enhances mRNA stability and translation. Nat Cell Biol 20, 285-295, doi:10.1038/s41556-018-0045-z (2018).
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