摘 要
16S rRNA擴增子分析和宏基因組測序是研究微生物群落的兩種主要的獨立方法。近年來，許多研究將這兩種方法結合起來使用，但下游的數據分析是分開進行的，在分類和功能上總是產生不一致或衝突的結果。
本文介紹了一種核糖體RNA基因區域測序的新方法RiboFR-Seq，同時捕獲核糖體RNA可變區及其側翼的蛋白編碼基因。
RiboFR-Seq不僅可以檢測到研究較多的微生物群落中的絕大多數細菌，而且還可以檢測到具有有限參考基因組的新群落中的絕大多數細菌。
RiboFR-Seq結合經典擴增子測序和隨機宏基因組測序，可以將16S rRNA和宏基因組的contigs的註釋鏈接起來，做出一致的分類。
RiboFR-seq通過識別幾乎所有的16S rRNA拷貝，可以有效地減少16S rRNA拷貝數變異引起的分類學丰度偏差。
背 景
16S rRNA擴增子的缺陷是16S rRNA 的多拷貝會影響對細菌丰度的準確評估。且它不能提供關於宏基因組功能的直接實驗證據。
隨機宏基因組測序的瓶頸是缺乏參考基因組和嵌合組裝，影響了基因組組裝和註釋的準確性和可靠性。因此與16S圖譜相比，它不能提供一個一致的微生物組成。且組裝過程中高度保守的核糖體RNA序列往往被錯誤地組裝在一起，或被視為重複序列而被過濾掉。
方 法
RDP數據庫中下載細菌16S rRNA序列，挑出1400 nt以上的全長序列進行比對。比對後的序列通過限制性內切酶使用python腳本in silico進行消化(digested)。挑出可用的內切酶要滿足三個條件：
1. 超過一半的序列可以被消化；
2. 只有一個識別位點，且離16S任意一個可變區很近；
3. 16S rRNA序列的粘性末端被裂解。
酶解的基因組DNA片段具有粘性末端，通過直接分子內連接實現自循環。
樣本中16S rRNA的V4區和V6區被單獨擴增；
通過長鏈反轉錄聚合酶鏈反應(long distance-inverse polymerase chain reaction，LD-IPCR) 從酶解後的環狀DNA中獲得基因組DNA片段。
（A）同時捕獲核糖體RNA可變區及其側翼序列；
（B）RiboFR-Seq的實驗流程圖。限制性內切酶的識別位點為6-bp，可以裂解細菌的16S rRNA序列，用於消化宏基因組DNA。酶解後的DNA片段具有粘性末端，通過分子內部連接的方式組成自循環，作為帶有特異性反向引物的LD-IPCR模板。自循環後用外切酶消化剩餘的線性基因組DNA。
數據分析。16S和宏基因組可以單獨分析，也可以對應起來進行分析。對於一條序列，如果可以連接16S和宏基因組序列，則被稱作
‘bridge read pairs’(BRPs)。該方法可用於16S rRNA與宏基因組之間的一致性註釋，準確定位組裝後的contigs/scaffolds中的多個16S rRNA序列，輔助宏基因組的組裝，並檢測16S基因拷貝數。
結 果
RiboFR-Seq得到的物種註釋更多且更準確，且可以對16S結果進行糾錯。
用RDP和RiboFR-Seq對口腔樣品16S V6得到的590個高丰度物種進行屬水平註釋。RDP分類器在50%的置信閾值下總共可以在屬水平上標註330個物種。使用RiboFR-Seq，通過contigs的附加註釋，89%物種可以在屬水平進行分類。
C.16S V6區擴增結果。每個點為一個序列，大小表示丰度。連接表示兩個序列存在單核苷酸差異。
D.三個菌16S與宏基因組序列。紅點為16S rRNA基因，灰色為宏基因組contigs/scaffolds
END
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