白樺是愛情的象徵？花語是生與死的考驗？小編帶著十萬個為什麼找到了度娘，度娘把回憶定格在了二戰的蘇聯，小編似乎看到了硝煙中的偵查兵和在白樺林苦苦等待他的姑娘，立刻對白樺林充滿了無限神往。近日中國科學院新疆生態與地理研究所王玉成團隊在Journal of integrative plant biology發表了一篇關於白樺滲透耐受性的研究論文，安諾優達為本研究提供了ChIP-Seq和RNA-Seq技術服務，接下來讓我們一起走進這片美麗的白樺林，看看中科院的白樺背後又有哪些奇妙的故事~
白樺BpHOX2轉錄因子與不同的順式作用元件結合並賦予滲透耐受性
研究內容
水分是影響植物生長的重要因子，當環境水勢低於植物體內水勢時，植物體不能正常吸水甚至失水，從而引起滲透脅迫，破壞植物正常的生命活動，嚴重時導致植物死亡。同源域-亮氨酸拉鍊（HD-Zip）蛋白在植物發育和環境應答中發揮著重要作用，除了參與植物生長髮育的功能外，還能夠響應非生物脅迫，然而，它們是如何通過調控基因表達來提高非生物脅迫耐受性仍未可知。在本研究中，研究者從白樺中鑑定到一個編碼HD-Zip家族蛋白的基因BpHOX2，結合ChIP-Seq和RNA-Seq技術，明確了其調控滲透耐受性的生物學功能，並篩選得到了轉錄因子BpHOX2的順式作用元件，解析該基因在調節滲透耐受性方面的作用機制。
技術路線
主要研究結果
1. BpHOX2具有良好的滲透耐受性
前人研究表明BpHOX2可能參與了樺樹抵禦滲透脅迫的生物學過程，研究者在明確了該基因的表達特徵後，首先對BpHOX2的分子功能進行了探究，在成功構建了超表達植株（OE）和RNAi植株（RS）後，從中各自選出3個表達量較高的株系進行試驗。發現在正常情況下，各株系的株高和生長表型等指標無顯著差異。然而，在滲透條件生長25d後，OE株系仍保持綠色，而WT和RS株系均出現黃葉，且OE系的株高、鮮重和葉綠素含量、根重顯著高於WT株系，而RS系明顯低於WT株系。這些結果表明，轉基因植株具有顯著的滲透脅迫耐受性（圖1）。
圖1 BpHOX2具有滲透脅迫耐受性
2. BpHOX2通過降低細胞死亡和膜脂過氧化，提高滲透耐受性
滲透脅迫會引起植物細胞膜脂過氧化反應，進而對細胞膜產生損傷，造成部分細胞死亡現象。研究者接下來對細胞膜損傷、丙二醛MDA含量和失水率的進行了測定，發現當暴露在滲透脅迫條件下時，OE系細胞死亡減少，失水率降低，MDA含量最低，相對含水量最高，這些結果表明BpHOX2通過保護細胞免於死亡，降低膜脂過氧化，提高滲透耐受性（圖2）。
圖2 細胞膜損傷、MDA含量和失水率的測定
3. BpHOX2通過調節ROS清除能力提高滲透耐受性
植物受到滲透脅迫後，體內的一些保護酶，例如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等會通過清除活性氧降低膜脂過氧化對細胞造成傷害。研究者用NBT和DAB對植物葉片進行染色，發現OE的H2O2和O2-水平最低（圖3A）；進一步測定發現植物的H2O2含量與DAB染色結果一致（圖3B）；接下來研究者通過測定兩種主要活性氧清除酶SOD和POD的活性，發現在滲透脅迫條件下，與WT植株相比，RS系SOD和POD活性均顯著降低，而OE系SOD和POD活性顯著提高（圖3C、D）RT-qPCR檢測基因表達量也驗證了這一結果（圖3E）。因此，SOD和POD活性的增加應該是由BpHOX2誘導SODs和PODs表達引起的。
圖3 BpHOX2對ROS清除的調控分析
4. ChIP-Seq與RNA-Seq聯合分析篩選下游基因
對滲透脅迫下的過表達株系和野生型株系分別進行轉錄組測序，鑑定出了上調基因866個，下調基因587個。滲透脅迫條件下，BpHOX2過表達誘導了許多ROS清除相關基因的上調錶達。GO富集分析結果顯示，差異表達的基因在結合活性、催化活性、轉運蛋白活性、轉錄調節相關基因、代謝過程、細胞過程、刺激反應、生物調節相關基因中高度富集。RNA-Seq結果表明，上述基因在滲透脅迫條件下可以被BpHOX2的過表達所激活。
研究者又使用3個OE株系進行ChIP-Seq，尋找BpHOX2結合的基序和BpHOX2直接調控的基因。利用模因（Multiple EM for Motif Elicitation）程序對ChIP-Seq峰進行分析，確定可能被BpHOX2結合的Motif，利用RNA-Seq進行聯合分析，篩選順式作用元件，並進行EMSA驗證，結果顯示BpHOX2蛋白可以和脫水響應元件（DRE）、Myb-p binding box、2個新發現的順式作用元件進行特異結合。最後確定了BpHOX2可以結合不同的基序調控基因表達（圖4）。
圖4 BpHOX2結合的順式作用元素的測定
文章小結
基於上述研究，研究者得到了BpHOX2在滲透脅迫下的調控模型：滲透脅迫誘導BpHOX2的表達，BpHOX2蛋白與不同的順式作用元件結合，再作為轉錄激活因子和抑制因子調控相關基因表達，通過激活ROS清除能力和滲透調節，最終提高滲透耐受性（圖5）。本研究的結果為HD-Zip蛋白在非生物脅迫耐受性中的作用提供了重要的見解。
圖5 BpHOX2在滲透脅迫下的調控模型
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參考文獻
Zilong Tan, Xuejing Wen, Yucheng Wang. Betula platyphylla BpHOX2 transcription factor binds to different cis-acting elements and confers osmotic tolerance[J]. Journal of integrative plant biology, 2020 Jul 16.
