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毒力因子鑑定是病原菌致病機理研究的一個重要內容。目前廣為應用的是轉座子插入突變篩選（Tn-seq: Transposon insertion sequencing），然而這一技術手段有明顯的侷限性：不能研究必需基因（必需基因的插入突變是致死的）；並非所有的插入突變都能導致基因失活，因而要進行全基因組的研究需要過飽和的突變體庫；技術上建庫複雜，測序步驟繁瑣，失敗率高等。
病原菌致病機理研究中的另一個重要內容是感染過程中的瓶頸問題。細菌要成功侵染宿主需要一定的劑量，這是因為它們在侵染宿主的過程中需要突破一層層的屏障，在通過屏障時會不斷有細菌被清除。這些屏障主要來自宿主方面的壓力，比如營養限制，免疫響應等。就像攻城一樣，單槍匹馬無法成功，需要團體作戰，作戰過程中傷亡是不可避免的。通俗來講，突破屏障的過程就像菌群通過一個瓶口，瓶口的最窄處決定了能通過的最小菌群大小。而這個最小菌群就是能最後在宿主內存活並造成最終感染的關鍵。實際上，往往是由於少數幾個，甚至可能僅僅是一兩個細菌的存活和後續的增殖造成最終的感染。研究病原菌感染過程中的瓶頸，例如鑑定出那些能增強瓶頸效應的免疫應答，可能會為抗感染治療提供新的途徑。
2020年10月28日，來自瑞士的Jan-Willem Veening課題組（第一作者為劉雪博士，共一作包括來自加州大學聖克魯斯分校的助理教授Jacqueline Kimmey和來自法國巴斯德研究所的Laura Matarazzo）在Cell Host & Microbe上發表了題為“Exploration of bacterial bottlenecks and Streptococcus pneumoniae pathogenesis by CRISPRi-seq” 的文章。該研究講述了一種新的高通量研究病原菌致病機理的方法: CRISPRi-seq。CRISPR interference (CRISPRi)是一種基於CRISPR 系統利用dCas9(失活的Cas9,只有結合活性而沒有切割DNA活性)對基因敲低（knockdown）的技術【1,2】。該方法是將CRISPRi技術巧妙地和二代測序技術illumina sequencing 結合，可以高通量的篩選毒力因子，並且高精度的定量細菌感染過程中的瓶頸大小。
該技術的亮點如下：
1. 既適應於動物體內又適應於體外的可誘導的CRISPRi系統 (圖一)。這是首次報導的在細菌中能應用於動物體內誘導的CRISPRi系統。該系統可以用多四環素在體外實現強度可調的誘導，在體內可以有效的誘導CRISPRi系統敲低細菌中的靶標基因，從而適用於病原菌的致病機理研究。
圖一. 在肺炎鏈球菌中可以體內體外誘導的CRISPRi系統。
2. 該技術將CRISPRi和illumina sequencing巧妙結合。在設計sgRNA的時候，引入illumina amplicon的特徵序列，可以通過一步PCR迅速建庫（圖二）。建庫簡單，成本極低，穩定性高，可以通量化。
圖二. CRISPRi-seq的過程示意圖（以在體外的C+Y培養基上利用CRISPRi-seq對全基因組基因的重要性評價為例）。
3. 該技術既可以用於細菌的毒力因子的篩選，又可以用於定量細菌侵染過程中的瓶頸大小（圖三）。這是因為該CRISPRi誘導系統的調控非常嚴緊，在沒有誘導劑的情況下，沒有檢測到knockdown活性。因而sgRNA可以作為中性barcode用於瓶頸大小的定量計算。
圖三. CRISPRi-seq用於篩選毒力因子和定量細菌感染的瓶頸大小。
肺炎鏈球菌是一種重要的人類條件致病菌。它在正常情況下定植於人類的上呼吸道，不造成疾病。大約有27%-65%的兒童和<10%的成年人是該菌的正常攜帶者。當人的免疫功能低下時，該菌可以侵染肺部，血液，甚至大腦，從而引起肺炎、菌血症、腦膜炎等嚴重感染。老人，小孩，以及免疫系統受損人群均易感，該菌造成的感染每年在世界範圍內會造成超過百萬人口的死亡，嚴重威脅著人類的健康。更可怕的是，肺炎鏈球菌和流感病毒的共感染會進一步加強前者的致病性和致死性。比如，1918年肆虐全球的西班牙大流感，造成了千萬人口的死亡，是人類史上最致命的一次大流行。近年來，微生物學家和流行病學家對1918年的西班牙大流感的研究發現，超過95%的嚴重感染和死亡是由細菌共感染造成的，而其中絕大多數由肺炎鏈球菌的共感染造成【3】。2019年末爆發的新冠肺炎席捲全球，近期也有研究證實繼發性的細菌共感染是造成該疾病惡化的一個重要原因【4】。目前科學家對肺炎鏈球菌和流感病毒共感染有一定的認識，比如流感病毒可以破壞呼吸系統抗感染的天然屏障，從而促進細菌共感染的發生；細菌表達的部分毒力因子可以利用病毒感染後肺的生理和免疫變化來增強其侵染能力；病毒和細菌表達各自的毒力因子，協同抑制宿主的免疫應答等。然而，具體有哪些毒力因子起作用，它們是怎麼起作用的並不清楚。
針對這些問題，作者在肺炎鏈球菌模式菌株D39V中構建了一個含有1499個sgRNA的CRISPRi庫，該庫基本上靶標到了D39V菌株的所有基因。然後作者用CRISPRi-seq，對目前肺炎鏈球菌領域裡常用的小鼠肺炎模型進行了研究，發現該模型中細菌侵染過程存在著顯著的瓶頸效應：起始構建侵染模型時用的菌量是108CFU，侵染過程中有的小鼠體內的菌量可以降到25個，然而這僅僅25個存活下來的菌便可以進一步繁殖最後造成肺炎以及進一步的菌血症。由於sgRNA可以作為一個細菌的身份標記，因而通過追蹤sgRNA在庫中的丰度，可以一定程度上追蹤單個細菌的行為。該研究發現，在單細胞水平上，即使是用純系小鼠作為宿主，宿主之間仍然存在著很大的個體差異。這樣的觀察顯示了單細胞水平進行肺炎鏈球菌致病性研究的必要性。肺炎鏈球菌是一種人類專屬的條件致病菌，小鼠並不是其天然宿主，因此在小鼠模型中顯著的瓶頸效應是否在人類感染過程中也存在，是後續要研究的一個重要問題。
進一步，作者利用CRISPRi-seq技術對小鼠中的(肺炎鏈球菌-流感病毒)共感染模型進行了研究。一方面作者篩選得到了多個已知和未知的肺炎鏈球菌毒力因子，為肺炎鏈球菌的治療提供了潛在的靶標；另一方面，作者發現某些體外培養基中的必需基因，在宿主體內反而是非必需基因。由於之前缺乏在體內對必需基因進行研究的工具，這類基因有可能會被誤作有潛力的靶標。作者的這些發現有助於科學家更加合理地選擇有效治療靶標。
總之，在該研究中，作者主要將CRISPRi-seq用於肺炎鏈球菌的小鼠肺炎模型和共感染模的型究。但這樣的研究範式完全可以擴展到更多的病原菌中，針對更多種的動物模型進行致病機制和感染瓶頸研究，為病原菌的研究提供了新的思路和方法。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.chom.2020.10.001
參考文獻
1.Bikard, D. et al. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Res. 41, 7429–7437 (2013).
2.Qi, L. S. et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression. Cell 152, 1173–1183 (2013).
3.McCullers, J. A. The co-pathogenesis of influenza viruses with bacteria in the lung. Nat. Rev. Microbiol. 12, 252–262 (2014).
4.Vaillancourt, M. & Jorth, P. The Unrecognized Threat of Secondary Bacterial Infections with COVID-19.mBio 11, (2020).
