責編丨兮
近年來RNA化學修飾研究引起了學術界的密切關注。在迄今為止已經鑑定的150多種RNA化學修飾中，m6A（N6-甲基腺嘌呤）修飾是哺乳動物細胞信使RNA (mRNA)內部丰度最高的鹼基化學修飾 (3-5 m6A/mRNA)，其生物學功能研究也最為廣泛，近乎影響RNA代謝壽命過程中的每一個環節，包括轉錄、剪接、降解、翻譯和運輸等。這些研究成果的取得都得益於m6A檢測和測序技術的發展，其中2012年發表的基於m6A抗體免疫沉澱的高通量測序技術(m6A-seq【1】或稱MeRIP-seq【2】)最為常用，但該方法只能提供100-200核苷酸的檢測窗口。
為了深入理解m6A甲基化的功能，單鹼基分辨率信息是必需的，它能在鹼基層次上幫助我們理解細胞內甲基化的機理和功能。領域內先後探索了一些RNA m6A單鹼基或近乎單鹼基分辨率的測序方法，包括基於抗體/RNA光交聯的方法（PA-m6A-seq、miCLIP等）、基於RNA m6A甲基化敏感的內切酶法 （m6A-REF-seq或稱MAZTER-seq）、基於m6A結合蛋白融合鹼基編輯蛋白的方法（DART-seq），這些方法都促進了領域的發展，但多數都是間接的手段（除m6A-REF-seq外）。基本原理是通過抗體-RNA光交聯位點的鹼基逆轉錄突變信息或者特異性蛋白-RNA結合區域附近鹼基的編輯信息，來判斷突變點或編輯點近鄰的腺嘌呤為m6A，這往往會在真實位點鑑定（尤其是簇位點）上產生偏差。m6A-REF-seq方法是一個好的直接方法，但是當前的內切酶只對m6ACA序列響應，還有大部分其它甲基化基序序列未被測出。因此，該領域還需要發展新的m6A單鹼基分辨率測序方法，解決當前存在的問題。
2020年4月27日，浙江大學高分子科學與工程學系劉建釗課題組在Nature Chemical Biology上長文發表題為A metabolic labeling method detects m6A transcriptome-wide at single base resolution的研究，報道了一種稱為m6A-label-seq的高通量測序方法，通過細胞自身代謝對全轉錄組RNA m6A位點進行標記，標記位點可發生化學處理誘導的逆轉錄鹼基突變，進而實現單鹼基分辨率測定。
細胞內S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是甲基轉移酶的輔助因子，可在mRNA m6A甲基轉移酶(METTL3/METTL14)的作用下，將其甲基轉移到mRNA上的特定腺嘌呤的N6位點形成m6A。SAM是以甲硫氨酸和三磷酸腺苷（ATP）為原料，在甲硫氨酸腺苷轉移酶（MAT）的催化下合成的。作者從甲基化源頭考慮，引入帶有烯丙基修飾的甲硫氨酸，在細胞內MAT作用下生成烯丙基取代的輔助因子allyl-SAM或者硒代同源物allyl-SeAM (圖1)。細胞內METTL3/METTL14利用allyl-SAM或allyl-SeAM，將其烯丙基修飾到mRNA上原本是m6A的位點，得到a6A（N6-烯丙基腺嘌呤），a6A在溫和的碘加成條件下誘導生成環化1,6位環化腺嘌呤(cyc-A) (圖1)，然後，RNA cyc-A在逆轉錄成互補DNA（cDNA）時發生鹼基錯配【3】。最後，藉助高通量測序和生物信息學分析突變位點，得到了全轉錄組m6A位點的單鹼基分辨率圖譜。
圖1. 示意圖描述利用代謝標記測定RNA m6A精確位置的方法
作者利用m6A-label-seq方法對人體HeLa和HEK293T細胞系以及老鼠H2.35細胞系的mRNA m6A位點、位點距離、m6A共有基序(m6A motif)等信息進行了系統分析。為了驗證該高通量測序方法的準確性，作者選取了個體基因進行了低通量的測序驗證。作者同時也將m6A-label-seq與miCLIP-seq、m6A-REF-seq、DART-seq等已知測序數據進行了對比，選取了16個特徵位點，用獨立正交的SELECT【4】 m6A鑑定方法驗證了這些位點的可靠性。
綜上，該研究的測序方法特點如下：（1）利用代謝對甲基化位點的源頭標記並直接單鹼基分辨率測定，相對於當前的間接方法有更高的準確率；（2）適用於細胞內RNA多種不同甲基化序列(m6A motif)的鑑定；（3）對測定m6A簇修飾有優勢。該方法為將來研究細胞核內種類繁多的新生RNA的m6A甲基化位點及狀態演變提供了重要工具。另外，該方法在標記產率和標記時間窗口尺度方面還需要優化提高，為研究更多的細胞事件過程提供便利。
浙江大學高分子科學與工程學2017級直博生
舒瀟與2016級直博生曹婕同學為本論文的共同第一作者，劉建釗研究員為通訊作者。通訊作者也是浙江大學生命科學研究院兼職PI。
在同期雜誌，北京大學賈桂芳課題組發表了“Antibody-free enzyme-assisted chemical approach for detection of N6-methyladenosin”的研究論文。
該方法巧妙地利用m6A的去甲基酶FTO蛋白作為催化劑，將mRNA上化學惰性的m6A轉化為高反應活性的中間態產物N6-羥甲基腺嘌呤（hm6A），然後利用二硫蘇糖醇（DTT）的巰基與hm6A發生亞胺1,2加成反應，將不穩定的hm6A轉化為更穩定的巰基加成產物dm6A。dm6A上的自由巰基可以與甲烷硫代磺酸（methanethiosulfonate，MTSEA）快速反應，實現在mRNA上m6A的位置標記生物素Biotin，最終可被鏈黴親和素珠捕獲，從而富集含有m6A修飾的RNA片段供後續高通量測序使用。此方法被命名為m6A-SEAL（FTO-assisted m6A selective chemical labeling method）。
在人HEK293T細胞的polyA+ RNA上應用m6A-SEAL之後，研究者們鑑定到了8605個高置信度的m6A位點，這些位點符合m6A的保守序列（RRACH）和分佈模式。早期利用m6A抗體測序技術在不同的植物中鑑定出了非經典的m6A保守基序（UGUA），但難以判斷該結果是否來自抗體非特異性富集信號。研究者們在水稻中應用m6A-SEAL也鑑定到了UGUA的非經典基序，並驗證了其真實性。最後通過該研究組之前開發的基於qPCR的m6A單位點檢測方法SELECT驗證了多個m6A位點，證明m6A-SEAL作為化學共價交聯技術，要比基於抗體的方法或DART-seq具有更高的可靠性和靈敏度。
此外，除m6A外，FTO還對RNA5’帽位置的N6,2'-O-二甲基腺嘌呤 (cap m6Am）具有催化活性，能將其催化為hm6Am。為了驗證m6A-SEAL測序方法是否還會同時檢測cap m6Am，研究者們通過體外酶活性實驗和標記實驗發現目前m6A-SEAL方法中使用的FTO氧化反應條件只能特異性將m6A反應成hm6A，通過優化FTO氧化反應條件可以實現m6A-SEAL只針對cap m6Am的標記和測序。
總之，該項研究首次利用FTO酶輔助實現了m6A化學標記，併成功應用於高通量測序。m6A-SEAL具有高靈敏度和高特異性的特點，可以應用於少量mRNA樣品中。未來研究者們將繼續對m6A-SEAL進行優化和改造，以實現單鹼基分辨率。由於FTO可以氧化催化RNA的cap m6Am和DNA的N6-甲基脫氧腺嘌呤（6mA），未來m6A-SEAL通過優化有望應用於這些化學修飾的測序。同時該方法除了可以在m6A上標記biotin用於富集，還可以標記熒光素，未來用於m6A的成像。
北京大學賈桂芳實驗室已畢業的博士研究生王燁為論文的第一作者，已畢業的博士研究生肖雨 、博士後喻瓊和本科生董舜卿為共同作者，賈桂芳研究員為通訊作者。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41589-020-0526-9
https://www.nature.com/articles/s41589-020-0525-x
參考文獻
1. Dominissini, D. et al. Topology of the human and mouse m6A RNA methylomes revealed by m6A-seq. Nature 485, 201-U284 (2012).
2. Meyer, K. D. et al. Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3 ' UTRs and near stop codons. Cell 149, 1635-1646 (2012).
3. Shu, X. et al. N6-allyladenosine: a new small molecule for RNA labeling identified by mutation assay. J. Am. Chem. Soc. 139, 17213-17216 (2017).
4. Xiao, Y. et al. An elongation- and ligation-based qPCR amplification method for the radiolabeling-free detection of locus-specific N6-methyladenosine modification. Angew. Chem. Int. Ed. 57, 15995-16000 (2018).
