日前，一項刊登在國際雜誌Cell上題為“CRISPR-Based Therapeutic Genome Editing：Strategies and In Vivo Delivery by AAV Vectors”的綜述文章中，來自馬賽諸塞大學醫學院等機構的科學家們描述了以CRISPR為基礎的改善人類健康的策略，其重點是通過利用AAV載體將CRISPR療法直接導入人體，此外，研究人員還討論了目前廣泛應用基於CRISPR療法所要面臨的挑戰，並強調了持續的研究和技術革新對於推動基於CRISPR療法在人類疾病研究中的重要性。
圖片來源：Dan Wang,et al. Cell,doi:10.1016/j.cell.2020.03.023
目前應用基於CRISPR的治療性手段能直接應用於患者體內，有望治療多種人類疾病，儘管基於CRISPR的工具箱能夠對DNA和RNA編輯及基因表達調節進行多種操作，但其藥物的運輸仍然是該療法發展的瓶頸，目前，腺相關病毒（AAV）載體是進行體內基因治療的主要載體；AAV非常安全，其能將單鏈DNA（ssDNA）載體基因組運輸到多個組織和細胞類型中，而且僅在一定劑量範圍內具有輕度的免疫原性；儘管載體基因組在宿主細胞內大部分處於遊離狀態，但通過共分化和環化來介導有絲分裂後細胞內長期的轉基因表達，就能使其穩定下來併產生持久的治療效果，AAV載體在運輸基因療法到疾病動物模型和患者中推動了基於CRISPR療法在治療多種疾病中的應用。
AAV-CRISPR療法的進展也面臨著AAV基因療法發展中普遍存在的一系列障礙，比如預先存在的對AAV衣殼的免疫力及載體誘導的免疫反應、運輸效率和特異性及AAV載體的開發等；此外，臨床應用的AAV-CRISPR也提出了獨特的挑戰，其就需要獨特的解決方案；在已有抗Cas9免疫存在的情況下，將定向Cas9蛋白直接運輸到人體是否會降低其安全性或治療效果，這仍然有待於進一步評估；解決免疫原性問題的潛在途徑包括使用免疫正交Cas9標準且進一步探索CRISPR系統的自然多樣性，從而識別可能對人類免疫原性較低的新酶；此外，多種蛋白質工程化方法也能夠改善臨床相關的特徵，比如為了更好的免疫功能而繪製和編輯表位。
對於任何基因組編輯療法都需要仔細評估脫靶編輯效應，近年來，科學家們開發出了多種方法來分析基於CRISPR試劑的脫靶特性；儘管這些方法在核酸序列水平上能提供對脫靶點的敏感性測定，但任何脫靶事件的潛在生物學後果在很大程度上都必須通過經驗來進行評估；由於脫靶效應會嚴重依賴於物種特異性的基因組序列和體內給藥的方式，因此，在細胞或組織水平下利用人源化動物模型就能夠提供有價值的臨床前信息，為了改善特異性，多種蛋白質工程學方法就能夠產生高保真度的Cas和Cas效應融合蛋白。以CRISPR為基礎治療手段的其它組分，比如sgRNA和供體模板，就能夠被修飾從而增強編輯的準確性和編輯效率。
除了脫靶編輯之外，目標編輯還會導致產生一些不希望發生的編輯事件，比如延伸到附近基因的大片段缺失、染色體重排（包括倒位和易位）及AAV載體基因組整合等；分析這些事件通常需要一系列不同於監測脫靶裂解的技術，而值得注意的是，治療性的基因組編輯策略會協同編輯器的作用以及該編輯器所誘發的多種細胞過程，比如利用核酸酶活性的情況下進行的DNA損傷修復，因此，更好地理解相關細胞過程或能為改善基因組編輯的安全性提供更多寶貴的見解。
圖片來源：Dan Wang,et al. Cell,doi:10.1016/j.cell.2020.03.023
疾病動物模型是轉化研究和療法開發中的關鍵，由於體內遞送是AAV-CRISPR療法的主要瓶頸，因此直接在疾病動物模型中進行檢測是評估療法有效性的金標準，由於AAV基因替代療法旨在運輸功能性的基因拷貝來糾正引發疾病的基因拷貝，因此由多種基因敲除策略所建立的動物模型通常情況下是足夠的。相比之下，諸如鹼基編輯（base editing）和prime編輯（prime editing）等多種基因組編輯策略通常會靶向作用特定的突變，因此攜帶有意設計工程化突變的動物模型就需要提供一個合適的檢測憑條，比如，研究人員會開發出攜帶代表性肌營養不良蛋白基因(dystrophin gene)突變的多個DMD小鼠模型來闡明多種基因編輯療法的有效性；儘管基於CRISPR基因編輯技術的出現極大地促進了遺傳性修飾動物的產生，但由於缺乏攜帶患者相關基因突變的適合動物模型，這對於科學家們而言仍然是一大挑戰，而開發簡單、強大且快速的動物模型方法或許就會加速精準基因編輯策略的開發。
CRISPR和AAV僅僅是闡明人類能夠利用自然系統來開發革命性生物技術的兩個例子，其凸顯了對自然多樣性理解和欣賞給科學家們帶來的機遇，然而對微生物機體進行適應性改造來滿足人類的需求並不能保證一定會成功；這個適應過程涉及多個跨學科的研究領域，比如微生物學、生物化學、分子生物學、蛋白工程學、結構生物學和生物信息學等，對於基於CRISPR的技術而言，其設計和利用的簡單性並不應該掩蓋共享有價值資源和技術的重要性，比如從質粒到sgRNA文庫，再到轉基因動物和生物信息學工具等，其能夠鼓勵科學家們進行交叉驗證並快速採用該技術進行新的應用，同時也能夠促進科學家們繼續快速進行科學研究。
一般而言，運輸是阻礙體內基因療法最主要的障礙之一，包括基因編輯治療性手段；AAV載體是目前最有效的基因運輸工具，同時其也是被批准能將基於CRISPR的基因編輯療法直接運輸到人類體內的唯一一個運輸載體。關於目前正在進行的AAV-CRISPR臨床試驗並對這些方法的優缺點進行分析將會是非常讓人激動的，這種改進預計會來自於對基於CRISPR試劑進行修飾以適應AAV載體的內在特性，以及目前正在進行的AAV生物學和矢量學研究，將這兩個領域的研究成果進行合併或有望產生一個更為廣泛的傳遞平臺，從而使其更好地服務於新型的分子療法中。（生物谷Bioon.com）
參考資料：
Dan Wang, Feng Zhang, Guangping Gao. CRISPR-Based Therapeutic Genome Editing: Strategies and In Vivo Delivery by AAV Vectors, Cell, 2 April 2020, Pages 136-150, doi:10.1016/j.cell.2020.03.023
