孝昭仁皇后崩逝後，康熙帝不敢再輕易冊立皇后，直到康熙二十八年，攝六宮事的皇貴妃佟佳氏病重，康熙帝才冊立其為皇后，但佟佳皇后僅在位一天。
孝懿仁皇后畫像
佟佳皇后生於康熙初年，滿洲鑲黃旗人，姑媽為康熙帝生母孝康章皇后。孝康章皇后為三等精奇尼哈番佟圖賴之女。佟妃於順治十一年為順治帝生下皇子玄燁。順治十八年，康熙帝玄燁即位後，佟妃被尊為聖母皇太后，上徽號慈和皇太后。佟圖賴被追封為一等承恩公。佟氏家族賜姓佟佳，由漢軍旗入滿州鑲黃旗。康熙元年，慈和皇太后的哥哥佟國綱授從一品內大臣。康熙二年，慈和皇太后崩逝，康熙帝悲傷不已，對佟佳家族照撫有加。佟佳皇后之父佟國維是慈和皇太后的弟弟。康熙九年，佟國維授內大臣。
康熙帝母孝康章皇后畫像
佟國維之女大約在康熙十五年入宮，當時康熙帝原配嫡後孝誠仁皇后已經崩逝，後宮由皇妃鈕祜祿氏主持。
康熙十六年，佟國綱承襲一等公。同年八月二十二日，康熙帝冊立鈕祜祿氏為皇后的同時，也首次大規模冊封妃嬪。康熙帝的表妹佟佳氏因“篤生名族、克備令儀、賦質端良、稟心恭順”，被封為僅次於皇后的貴妃。
康熙十七年二月二十六日，孝昭仁皇后鈕祜祿氏崩逝。佟佳貴妃從此管理康熙帝后宮。她“溫惠宅心、端良著德、夙夜維勤、言容有度”，很受太皇太后、皇太后和康熙帝的喜愛。
康熙十七年十月三十日，宮女烏雅氏生皇四子胤禛。康熙帝命佟佳貴妃撫養。佟佳貴妃對養子盡心盡力，二人感情十分深厚。胤禛視佟佳家族為外家。
康熙二十年十二月二十日，在平定三藩叛亂的喜慶氣氛中，佟佳貴妃進封皇貴妃。佟佳皇貴妃伯父佟國綱授鑲黃旗漢軍都統。次年，佟佳皇貴妃父佟國維授正一品領侍衛內大臣。
此後，九卿諸臣屢以冊立中宮上請，但已經兩次喪妻的康熙帝內心顧慮重重，不敢再次立後。表面上看，康熙帝不肯冊立佟佳皇貴妃為皇后似乎是對她的不公，但其實是對她的在乎。對此，佟佳皇貴妃深深理解，也從來不在康熙帝面前索取後位。
孝懿仁皇后所居承乾宮
康熙二十二年六月，佟佳皇貴妃生皇八女，但此女於次月殤。
同年，佟佳皇貴妃養子胤禛進尚書房，師從翰林院學士張英，張英之子張廷玉由此成為胤禛的伴讀。張英曾是皇太子胤礽的師傅，此後還擔任專管東宮事務的詹事府詹事。胤禛自幼就和太子關係甚好，很可能是受張英的影響。
清帝十分重視皇子教育。皇子6歲開始讀書。每天的讀書時間為早晨5點至下午3點，共計10個小時。皇子讀書要正襟危坐。尚書房只有元旦、端陽、中秋、萬壽(皇上的生日)、自壽(自己的生日)這幾天放假，除夕也不放假。每天放學後，吃過晚飯，皇子們還要學習騎馬射箭。
康熙二十八年，胤禛十一歲，佟佳皇貴妃病重。七月初八，康熙帝諭禮部：“奉皇太后慈諭，皇貴妃佟氏孝敬性成、淑儀素著。鞠育眾子、備極恩勤。今忽爾遘疾、勢在瀕危。予心深為軫惜。應即立為皇后、以示寵褒。”
初九日，冊立皇后，遣官告祭天地、太廟，頒詔天下。初十日申刻，皇后於承乾宮崩逝。十一日，奉安大行皇后梓宮於承乾宮正殿，康熙帝輟朝成服，妃嬪皇子以下鹹成服。十三日，奉移大行皇后梓宮至朝陽門外享殿，康熙帝親臨送，在那裡守候了九天。
康熙帝畫像
康熙帝悲從中來，不能自己，握管言情，聊抒痛悼，寫下了四首傷懷詩。
第一首
月掩椒宮嘆別離，傷懷始覺夜蟲悲。
淚添雨點千行下，情割秋光百慮隨。
雁斷衡陽聲已絕，魚沉滄海信難期。
繁憂莫解衷腸夢，惆悵銷魂憶昔時。
第二首
交頤淚灑夕陽紅，徒把愁眉向鏡中。
露冷瑤階增寂寞，煙寒碧樹恨西東。
舊詩詠盡難回首，新月升來枉照空。
鸞影天涯無信息，斷絃聲在未央宮。
第三首
音容悲漸遠，涕淚為誰流。
女德光千禩，坤貞應九洲。
涼風銷夜燭，人影散瓊樓。
嘆此乎生苦，頻經無限愁。
第四首
淅瀝動秋聲，中心鬱不平。
離愁逢葉落，別恨怨蛩鳴。
寂寂瑤齋閣，沉沉碧海橫。
玉琴哀響輟，宵殿痛殘更。
值得一提的是，佟佳皇后是唯一一位獲得康熙帝賦詩懷念的女子。
二十二日，康熙帝封佟佳皇后之父佟國維為一等公，世襲罔替。
九月二十二日，冊諡孝懿皇后。
十月二十日，奉移孝懿皇后梓宮安葬景陵地宮。
康熙六十一年，康熙帝駕崩，孝懿仁皇后養子胤禛即位。
十二月，雍正帝諭內閣：“孝懿皇后，徽音淑德、慈撫朕躬、恩勤備至、尊諡孝懿溫誠端仁憲穆奉天佐聖仁皇后。”
雍正元年九月，正式冊諡。雍正帝在冊文中讚譽養母：“欽惟皇妣孝懿仁皇后，毓粹高門。騰芬戚畹。佐顯承之弘烈、壼政勒修。篤慈愛之盛心、母儀懋著。履和思順、致誠孝於彤闈。尚儉懷謙、翼昇平於黼座。撫沖齡而顧復、備蒙鞠育之仁。溯十載之劬勞，莫報生成之德。緬宮庭之佑啟，翟舀如存。感歲月之遷流、萱幃久閟。追維慈覆、彌懷高厚之恩。誕紹丕基，倍切顯揚之願。謹奉冊寶，恭上尊諡。”
同月，以升祔太廟禮成。頒詔天下。詔曰:“皇妣孝懿皇后純粹天根。敬恭性蘊。動循禮則。行法前修。慈撫朕躬。恩勤篤摯。”
事實上，雍正帝和生母之間的感情相當淡漠。烏雅氏對幼子的偏心讓胤禛內心十分失落，他深深懷念自己的養母孝懿仁皇后。在九子奪嫡的大戰中，以隆科多為首的佟佳家族給了雍正帝極大的支持。雍正帝即位，命隆科多與大學士馬齊總理事務，並且承襲一等公爵位，授吏部尚書。隆科多可以不經奏請，任意挑選人才，當時被稱為“佟選”。雍正元年，隆科多與川陝總督年羹堯一起加封為太保。雍正二年，隆科多充任纂修《聖祖實錄》、《大清會典》的總裁，並且監修《明史》。儘管後來，雍正帝為了鞏固皇權，罷免了隆科多。但是他並沒有遷怒於佟佳家族。他尊孝懿仁皇后妹妹為皇貴太妃。佟佳家族的兩個世襲一等公爵沒有被褫奪。其中，孝懿仁皇后伯父佟國綱一系後來還出了道光帝孝慎成皇后。孝懿仁皇后弟弟慶復雍正五年承襲一等公爵位。乾隆帝即位之初，就命慶復代替平郡王福彭為定邊大將軍，出北路進擊準噶爾，回京後署理吏部尚書，併兼管戶部、刑部事務，不久出為兩江總督。乾隆十年，拜為文華殿大學士，留任川陝總督。
雍正帝畫像
乾隆元年三月，為孝懿仁皇后加上尊諡“和恪”。
嘉慶四年五月加上尊諡“慈惠”。全諡曰：孝懿溫誠端仁憲穆和恪慈惠奉天佐聖仁皇后。
