撰文 | 亨利
新冠肺炎疫情發生以來，全球科學家們和醫生們都在尋找藥物，以減少感染人數，結構生物學家們也在此次疫情中進行了廣泛的科學研究，從最早饒子和院士課題組公佈Mpro蛋白結構推動藥物篩選（中科院上海藥物所/上科大聯合研究團隊發現一批可能對新型肺炎有治療作用的老藥和中藥），到ACE2-RBD的解析（Nature背靠背｜王新泉/張林琦、李放分別發表新冠病毒與人ACE2受體複合物結構），科學家們為推動藥物研究提供了重要的結構依據。
而在新冠病毒的所有蛋白中，Mpro和RdRp被認為是兩個最重要的病毒靶點，在病毒的生命週期中，有一個重要的過程就是複製，新冠病毒的複製複合物主要由病毒的非結構蛋白（nsp）的多亞基轉錄複合物組成，核心成分主要是RNA依賴的RNA聚合酶催化亞基（nsp12），而nsp12的功能發揮也需要nsp7和nsp8兩個輔因子參與，它們的加入將促進nsp12與RNA模版的結合，同時也成為了核苷酸類似物例如瑞德西韋（Remdesivir）的作用靶標。
Rdrp活性實驗以及瑞德西韋抑制試驗
2020年5月1日，中國科學院上海藥物研究所徐華強研究員、浙江大學張巖教授、北京協和醫院張抒揚教授和上海藥物研究所許葉春研究員等合作在Science雜誌上發表文章Structural Basis for the Inhibition of the RNA-Dependent RNA Polymerase from SARS-CoV-2 by Remdesivir，解析新冠病毒複製酶與瑞德西韋複合物結構（該文章曾於4月9日發表在預印版平臺bioRxiv上）。
為了闡釋新冠病毒與RNA的相互作用，以及瑞德西韋的藥物作用機制，研究者們首先通過昆蟲細胞共表達了新冠病毒的複製酶三元複合物，通過EMSA實驗驗證了複合物與RNA的結合，緊接著經驗豐富的藥物化學家沈敬山等指出三磷酸形式的瑞德西韋（Remdesivir-TP）才有可能抑制RdRp，併合成了Remdesivir-TP用於結構測定，同時，作者們首次利用了體外生化實驗，建立了新冠病毒複製酶活性的測定方法，並且通過Remdesivir-TP和Remdesivir設計和建立了藥物抑制試驗，揭示了Remdesivir-TP才是最終發揮活性的小分子形式。
本研究在饒子和院士課題組前期的RdRp研究（詳見此前BioArt的報道：饒子和團隊解析新冠病毒RNA依賴RNA聚合酶（瑞德西韋靶點）高分辨率結構，該工作已於2020年4月10正式在Science雜誌在線發表）的基礎上，進一步通過冷凍電鏡獲得了2.8埃分辨率的apo複合物結構和2.5埃分辨率的複製酶/RNA/瑞德西韋複合物，兩個結構總體上十分接近，研究者們在模板引物RNA和nsp12之間觀察到廣泛的蛋白質-RNA相互作用，其中nsp12共有29個殘基直接參與RNA的結合，出乎意料的是，儘管RdRp的RNA結合需要這兩種蛋白質，但nsp7或nsp8並未介導RNA相互作用。
RdRp的催化活性位點七個保守基序構成，同時研究者們也觀察到了拇指亞域中D618和S814參與了催化中心兩個鎂離子的配位。
nsp12複合物apo結構
複製酶/RNA模版/瑞德西韋複合物結構
結構比較發現，apo蛋白結構和後者結構之間的一些差異。第一個差異在於nsp7的位置似乎朝nsp核心移動了1.0到1.7Å，導致與第二個nsp8的連接重排；在連接拇指亞結構域的第一個和第二個螺旋的環中觀察到第二個差異，該環向外移動了4.7Å，以適應雙鏈RNA螺旋的結合，同時，基序G殘基K500和S501也向外移動2.0埃，同樣發揮適應模版結合的作用。
除了瑞德西韋，其它幾個核苷酸類似物如Favipiravir（法匹拉韋）, Ribavirin（利巴韋林）,Galidesivir（BCV4430）和EIDD-2801也有相似的作用機理，可以有效地抑制細胞內SARS-CoV-2的複製。因此研究者們也通過結構解析揭示了這些藥物是如何抑制SARS-CoV-2 RdPp的活性。有趣的是，EIDD-2801抑制病毒複製的效果是瑞德西韋的3-10倍。
在新冠病毒的眾多蛋白中，RdRp被認為是許多現有核苷酸類似物的主要靶標。在這篇文章中，研究者們報告的結構揭示了模板引物RNA如何被酶識別以及瑞德西韋對鏈延長的抑制作用。結構比較和序列比對錶明，底物RNA識別和瑞德西韋抑制RdRp的模式在多種RNA病毒的RdRp中高度保守，總之，這些發現為設計更有效的抑制劑對抗新冠肺炎的感染提供了理論依據，也為基於核苷酸類似物設計廣譜抗病毒藥物提供了基礎。
據悉，該研究由中國科學院上海藥物研究所徐華強研究員、浙江大學張巖教授、北京協和醫院張抒揚教授和上海藥物研究所許葉春研究員等共同完成，中科院上海藥物所蔣華良和沈敬山課題組在瑞德西韋三磷酸活性成分合成方面給予大力支持。中國科學院上海藥物研究所徐華強課題組博士後
尹萬超為論文第一作者，浙江大學博士後毛春友、清華大學醫學院博士生欒曉東，浙江大學研究助理沈丹丹和博士後沈慶亞，以及上海藥物研究所博士生蘇海霞為論文的共同第一作者值得一提的是，4月9日，上海科技大學饒子和/楊海濤團隊聯合中科院上海藥物所蔣華良團隊以及清華大學、軍事醫學科學院、中科院武漢病毒所等單位的研究人員合作在Nature雜誌在線發表了題為“Structure of Mpro from COVID-19 virus and discovery of its inhibitors”的論文，解析了新冠病毒水解酶Mpro的結構並基於該結構進行了藥物篩選並利用了細胞實驗評估了藥物效果，發現了具有較強病毒抑制作用的小分子（Mpro（水解酶）和Rdrp（RNA依賴RNA聚合酶）被認為是新冠病毒的兩大重要靶點，詳見BioArt報道：饒子和/楊海濤/蔣華良合作團隊解析新冠病毒水解酶結構並篩選出多種具有病毒抑制作用的小分子）。
原文鏈接：
https://science.sciencemag.org/content/early/2020/04/30/science.abc1560
關鍵字: RdRp 病毒 Remdesivir
