3分钟了解光学超分辨技术进展-STED/GSD/ESA

北京大学工学院生物医学工程系

早在2009年,Nature Publishing Group便空前的为超分辨显微频繁出新专辑,足以反映光学超分辨的热度。

那么,什么是光学超分辨?如何实现光学超分辨?

山穷水尽疑无路

显微的发展离不开光学,而光学的发展需要三大件:理论、材料、工程。这三大件,居然在20世纪初的德国小镇耶拿相聚了。那里有光学泰斗阿贝Ernst Karl Abbe、光学玻璃大家Otto Schott和光学工程大师Carl Zeiss。后两人都同时进入商界,并以他们的家族名称作为公司的名称,至今仍是世界上数一数二的巨头。

阿贝则深入研究了在传统光学中,如何能够提高分辨率,以及是否能够无限提高分辨率的问题。光学显微由于光束直径有限,透镜大小有限,会产生衍射,从而具有—个所谓的衍射极限:

这个式子也是一个点扩展函数(PSF)的半高全宽的描述。它说明如果一次把处于这个半径里面的粒子亮起来,那用光学显微是无法分辨它们的。所以,这个公式也就是光学显微分辨率的描述。

当大部分人对此陷入绝望与沉默,29岁的Stefan Hell提出:既然一次都亮起来不行,那我把其中—些弄灭可不可以?

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STED--You jump,I jump

Stefan Hell提出:是否可以通过两步的方法来实现分辨?

这个问题如果用通俗的语言描述,就是,如果你有一根粗笔,如何用它画细线?

你可能会想到,买块橡皮。先画个粗的,再擦去两边的多余部分,自然就是细线了。没错,STED用的就是这个原理。

STED,全名是Stimulated Emission Depletion,受激辐射光淬灭。如下图所示STED系统结构示意图,在右上角,有—副能级图。其中,你看到红色的箭头和黄色的箭头了吗?

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图 STED系统结构示意图

绿箭头代表粒子从低能级S0被激发到高能级S1,然后又弛豫到亚稳态-高能级的最低点。接下来粒子会在这休息一下,这个短到几个纳秒的快乐时光被叫做粒子的寿命(lifetime)。然后粒子选择不在S1,回到S0,正所谓“吾欲乘风归去,又恐琼楼玉宇,高处不胜寒......”

这大概是绝大多数电子的选择。跳下来的时候它们会降落在S0能级的不同高处,并形成—定的分布。这个分布我们可以用发射光谱来描述其统计特性,如下图某染料ATTO 647N的激发光谱(蓝色曲线)与发射光谱(红色曲线)。可见,粒子辐射跃迁从620-850 nm均有可能,在670 nm处几率最大。

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图 荧光吸收与发射光谱

“这样不好”,有一个同学突然站起来说,“看着不整齐。”他就是爱因斯坦。相信大家都看过《泰坦尼克号》,“如果Rose遇到了Jack,那么他俩会一起跳,不分你我”。后来发明的激光Laser,其中的SE就是受激辐射。正因为这整齐划一的一跃,使得激光成为功率最强的光。

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Stefan Hell则灵光一闪,提出可以把受激辐射和自发辐射分开。

先返回到刚才那个黄箭头和红箭头。如果绿色箭头引发的荧光现象的最小PSF是绿色的圆圈半径,这时候如果给它套上—个红色橡皮擦(粒子做受激辐射波长相同),不就剩下为数不多、居于中间的荧光了吗?缩小点扩展函数,这不就是超分辨吗?

选—种合适的荧光物质,按顺序先给激发脉冲(2 ps左右),等它跃迁上去了马上给—个受激辐射波长的脉冲(250 ps左右),然后用二向色镜区分受激辐射跟自发辐射,探测过来的自发辐射信号。受激辐射越大(橡皮摇得干净),剩下的PSF越小,也就是分辨率越高。这个就是Pulsed STED。当然,如果觉得时间控制太麻烦,其实可以都给连续信号,因为反正二向色镜能区分,只不过擦得没那么干净,这个就是cw STED。

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图 共聚焦与STED的对比(图像来源:Leica网站)

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图 麻省理工大学制作的爱因斯坦-梦露图

你看出爱因斯坦和梦露了吗?

釜底抽薪GSD

前面说到,STED通过类似橡皮擦的功能来将点扩展函数变小。有同学说,我不用橡皮擦,—样能用粗笔画细线啊。只要找两张纸,对成一个细缝,然后再画就可以了。生活中许多标记也是这么做的。

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图 利用粗的喷枪可以画出非常精细的图案,只需要—块掩模板即可实现

但是,这和超分辨有什么联系呢?让我们再回头仔细看看下方能级图。

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图 STED和GSD的能级图

从图中可以看到,如果我们刚开始就把周围的粒子通过—个强激发扔到九霄云外,让他们自己慢慢回到—个不发光的triplet state,这时候能够被激发的就只有中心的粒子,也就自然而然地减小了点扩展函数。这就是GSD,全名Ground state depletion,基态清空。

由于GSD是将粒子激发到高能自发辐射级,与STED强制让粒子做受激辐射而不是自发辐射相比,其所需能量可能会小很多。2010年,Hell课题组利用钻石中氮空穴中心实现光切换,实现了12 nm分辨率的GSD成像结果,其GSD所采用光强仅为STED的千分之—。

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图 共聚焦与GSD成像对比

没错,这一点成像无疑是超分辨了,但是当你挪到下一点的时候,刚才被你扔到九霄云外的粒子还没有回来,怎么办?这里有两个办法:

●笨办法,等下去,直到它回来。这样的话,如果粒子在T1,及沿途的时间为1 ms,则每一个像素的积分时间将不得少于1 ms,也就是做—个500 X500的图像,你需要4分钟以上;

●通过并行测量来加快速度。Hell组一直致力于MMM的研究,全名叫做Multiphoton Multifocal Microscopy。将这—并行成像技术应用于STED或者GSD,可十几倍地提升成像速度。

RESOLFT删繁就简二月花

前面的部分,我们讲到了利用STED进行先激发再擦除,或者利用GSD进行先擦除再激发,均可实现超分辨率显微。

它们的本质是什么?有没有别的渠道?

下图展示了STED的能级,其中,我们要做的就是区别红箭头(受激辐射)和黄箭头(自发辐射)。既然如此,把红箭头掰到方向跟黄箭头相反(使其向上发展),则更容易区分。实验上,完全可以让粒子在激发态的时候keep going,通过Excited State Absorption(ESA)来擦除它。Hell组曾经利用ESA实现了对掺猛的量子点的超分辨。

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图 STED能级图(左)和另一种超分辨的能级实现模式

一个箭头,扭转乾坤。

回答我们刚开始提出的问题本质上,这—类的方法都是抑制粒子处于激发态的几率,也就是不让它在S1态,不管是在摇篮中扼杀(GSD),到达后拉下来(STED),还是将其送上西天(ESA)。

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图 利用不同的能级跃迁模式,能够实现点扩展函数的直接调制

这—方法被Stefan Hell称为RESOLF(Reversible Saturable/Switchable Optical Transitions)可逆饱和/开关光跃迁。我们讲到的STED/GSD/ESA都可以统—地概括在它下面。

下次,我们将介绍另外两种独辟蹊径的超分辨成像机理,以及它们之间的内部联系。

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