从2016年FDA批准首个基于EGFR基因突变的液体活检产品，到今年8月bTMB被证实可以预测免疫治疗的效果，液体活检已在肿瘤治疗领域大放异彩。
不幸的是，血液中的肿瘤循环DNA分子含量通常远远低于血液中非癌症相关DNA的片段，这使得检测它们非常困难，特别是在癌症的早期阶段。
今天，英国剑桥大学科学家Nitzan Rosenfeld带领的团队，终于为液体活检打开了封印。他们发现了血液中循环肿瘤DNA和非肿瘤DNA片段的长度分布特征。找到了一种更灵敏的血液中肿瘤DNA检测方法。
研究者们在体外富集血浆中特定片段长度的游离DNA（cfDNA），然后测序，发现用测序结果区分肿瘤血液样本和健康血液样本时，曲线下面积超过0.99，而未富集的普通cfDNA检测只有不到0.8。此外，这种富集的方法可以使液体活检在更早期就能检测到癌症。这项研究发表在最新一期的著名学术期刊Science Translational Medicine上[1]。
前排中间为Nitzan Rosenfeld博士
血浆中存在着很多游离的DNA（cfDNA），包括肿瘤来源的（ctDNA），以及非肿瘤来源的。非肿瘤来源的DNA占了cfDNA的绝大部分，使得ctDNA的丰度很低[2]。以往的研究发现，只有当ctDNA在cfDNA中的丰度在10%或以上时，才能得到准确的肿瘤信息[3]。但是，除了某些晚期的肿瘤会释放大量ctDNA外，大多数肿瘤患者的ctDNA的丰度达不到这个标准[4]。
目前，主要是通过加大测序深度来提高ctDNA检测的灵敏度和准确率，但是加大测序深度可能会带来假阳性的结果，因为非肿瘤来源的DNA中也可能带有各种肿瘤相关的突变[5]。这些问题一直限制着液体活检的应用。
不过，科学家的另一个发现却可能解决这个问题。之前有研究表明，不同细胞释放到血液中的cfDNA的长度会有所不同，例如，很多cfDNA的长度都是167bp（与一个核小体的DNA长度类似），这可能与细胞凋亡过程中半胱天冬酶依赖的DNA裂解相关[6]。
婴儿的cfDNA就明显比母亲的cfDNA片段短，这个特点被运用与产前诊断[7]。这些研究说明不同细胞来源的cfDNA在长度上会呈现独特的模式，可能可以作为区分cfDNA来源的信号。
这种cfDNA片段长度的差异很可能就存在于肿瘤细胞与非肿瘤细胞之中。这是一个绝妙的假设，如果这个假设成立，就可能解决肿瘤液体活检面临的困境。
不过，之前少数几个在此方面的研究却得出了相互冲突的结果，使得这方面的研究裹足不前。他们的问题主要在于不了解造成这种生物学差异的原因[8]。也即，不知道肿瘤细胞的DNA长度为什么会不同，使DNA片段的长度特征信号无法准确地代替肿瘤cfDNA。
Nitzan Rosenfeld博士接过了这个研究的大旗。他们猜测之前研究者失败的原因，可能是得到的ctDNA片段的长度特征信号不够灵敏。
于是，Rosenfeld博士带领的研究者们设计新的方案进行了研究。他们从200个癌症病人中收集了344份血浆样本（包括18种不同类型的癌症），然后取了65个健康人的血清样本作为对照。提取这些血浆样本中的cfDNA后，分析发现健康人与癌症患者的cfDNA在90 - 150 bp、180 - 220 bp和250 - 320 bp之间的分布都有所不同。
当他们将这些cfDNA测序后发现了令人惊讶的结果，带有癌症突变的ctDNA片段普遍比核小体DNA片段（167bp）短20-40bp，在90-150bp区间富集，还有些在250-320bp之间富集（这可能是肿瘤细胞的双核小体片段）。
带肿瘤突变的片段在一个区间富集
以上结果可能预示着ctDNA在90-150bp区间的丰度可能会很高。研究者们在一种硅芯片上将cfDNA在按片段长度进行分离，通过测序发现在90-150bp区间中，ctDNA的丰度明显提高。
这说明可以通过富集短片段的方法提高ctDNA的丰度，进而能提高检测的灵敏度和准确性。于是，研究者们先用这种片段选择性测序的方法检测癌症病人的肿瘤进展，发现比CT成像提前了60天检测了肿瘤进展，而比未经过片段选择性的液体活检提前了89天。片段选择性测序显示了无与伦比的优势！
新方法的优势还不止于此，研究人员取了一个队列研究中48份肿瘤患者的血浆样品，分别通过cfDNA片段选择性测序和普通cfDNA测序，与已知结果相比，两者的准确率分别是82%和50%。片段选择性测序对准确率的提升幅度异常明显。
但是，科学家对这个结果还不是很满意，觉得它还有提升的空间。因为其他长度的片段上也存在肿瘤突变，而只取90-150bp的片段会丢失一些信息。这种粗犷划分显然不能代表现代科学的水平。
接着，研究者们将各个长度区间的片段，包括P（20 to 150），P（100 to 150），P（160 to 180）， P（180 to 220），以及 P（250 to 320），都进行了分析，结合已知的突变位点，
通过机器学习算法去寻找更加精细的规律，得到了一个人工智能模型。用这个模型在区分肿瘤血液样本和健康血液样本时，曲线下面积达到0.994，相当令人震撼！
片段特异性测序显示了完美的准确率
当然，作者表示他们的方法还有一定局限性，那就是他们在体外对不同片段长度的DNA进行分离的方法，会造成一定偏差。可能不能准确反应小于100bp和大于300bp长度的ctDNA。
尽管如此，从已达到的效果来看，这个通过片段特异富集进行液体活检的方法，可以更早更灵敏地检测肿瘤，这对于肿瘤的治疗有重要意义！
本文第一作者Moulier说道，理论上这项新技术可以用于检测所有类型的肿瘤。并且，这种技术对很多实验室来说都很简单，这意味着在不久的将来，它就能对公众开放[9]。
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[1]http://stm.sciencemag.org/content/10/466/eaat4921.full
[2] G. Siravegna, S. Marsoni, S. Siena, A.Bardelli, Integrating liquid biopsies into the management of cancer. Nat. Rev. Clin.Oncol. 14, 531–548 (2017).
[3] M. Murtaza, S.-J. Dawson, D. W. Y.Tsui, D. Gale, T. Forshew, A. M. Piskorz, C. Parkinson, S.-F. Chin, Z. Kingsbury, A. S. C. Wong, F.Marass, S. Humphray, J. Hadfield, D. Bentley, T. M. Chin, J. D. Brenton, C. Caldas, N.Rosenfeld, Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencingof plasma DNA. Nature 497, 108–112 (2013).
[4] C. Bettegowda, M. Sausen, R. J. Leary,I. Kinde, et al. A., Detection of circulating tumor DNA in early- andlate-stage human malignancies. Sci. Transl. Med. 6, 224ra24 (2014)
[5] I. S. Haque, O. Elemento, Challenges inusing ctDNA to achieve early detection of cancer.bioRxiv 237578 [preprint]. 21 December2017.
[6] S. Jahr, H. Hentze, S. Englisch, D.Hardt, F. O. Fackelmayer, R.-D. Hesch, R. Knippers, DNA fragments in the blood plasma of cancerpatients: Quantitations and evidence for their origin from apoptotic and necrotic cells.Cancer Res. 61, 1659–1665 (2001)
[7] Y. M. D. Lo, K. C. A. Chan, H. Sun, E.Z. Chen, P. Jiang, F. M. F. Lun, Y. W. Zheng, T. Y. Leung, T. K. Lau, C. R. Cantor, R. W. K. Chiu,Maternal plasma DNA sequencing reveals the genome-wide genetic and mutational profileof the fetus. Sci. Transl. Med. 2, 61ra91 (2010).
[8] H. R. Underhill, J. O. Kitzman, S.Hellwig, N. C. Welker, R. Daza, D. N. Baker, K. M. Gligorich, R. C. Rostomily, M. P. Bronner, J.Shendure, Fragment length of circulating tumor DNA. PLOS Genet. 12, e1006162 (2016).
[9]https://www.newscientist.com/article/2184604-blood-test-can-spot-dna-from-eight-different-types-of-cancer/
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本文作者 | 低温艺术家
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