RNA分子除了作為遺傳信息的傳遞者，還參與到多種不同的生物學過程中。RNA在從產生到降解的過程中，其結構對於行使特定功能非常重要。比如，RNA分子通過一定結構與RNA結合蛋白（RNA binding protein，
RBP）結合形成核酶（ribozyme），在RNA剪切（splicing）、翻譯（translation）等過程中起催化作用【1】；還有的RNA在面對不同的細胞環境或者與不同的離子結合時，能夠通過改變結構而調節基因的表達水平【2，3】。因此，研究RNA的二級結構能夠更好的理解其功能。
隨著研究的深入和技術的進展，RNA結構的測定已經從單個RNA水平進入到整個轉錄組水平的高通量研究【4】，從in vitro的模型研究轉變為in vivo實時動態的結構監測。傳統的技術如X-ray、NMR、cryo-EM、計算機模擬等難以滿足需要，而最近幾年發展起來的結合化學小分子探針的測序技術在高通量及in vivo研究中越來越體現出獨特的優勢。這類方法通過化學小分子探針修飾RNA鹼基以引入逆轉錄停止（Reverse Transcription stop, RT stop）或者突變（mutation），從而得到RNA鹼基所處的單雙鏈狀態（即RNA分子的二級結構信息）【4】。目前可以用於in vivo的RNA二級結構高通量測序技術的小分子主要有DMS（DMS-seq【5】、Structure-seq【6】 ）和SHAPE分子（icSHAPE【7】）兩類。這些新技術雖然已用於不同的研究中，但是仍然具有一定的侷限性。DMS分子在濃度較高時具有細胞毒性，且大部分是對鹼基的Hoogsteen face進行甲基化；SHAPE分子修飾的是鹼基的糖環部分，易水解而不穩定【8】。因此，特異性更強、毒性更低、更高效穩定的化學分子是提升RNA二級結構測序技術的關鍵。
2020年2月3日，來自芝加哥大學的何川教授團隊聯合武漢大學周翔教授團隊、清華大學張強鋒教授團隊在Nature Chemical Biology上在線發表了題為Keth-seq for transcriptome-wide RNA structure mapping的工作。該研究使用的N3-Kethoxal分子【圖1a】，能夠特異地和單鏈狀態的鳥嘌呤（G）反應【圖1b】，在逆轉錄時通過引入修飾鹼基的停止信號，在測序後得到RNA in vivo狀態的二級結構信息，並且通過富集顯著增強修飾信號【圖1c】 。N3-Kethoxal分子具有很好的細胞滲透性，加入細胞培養基後5分鐘左右RNA的標記即可達到飽和（圖1d），具有比其他分子更快的修飾效果【8】。此外，該分子的修飾在95 ˚C加熱後能被去除【圖1e】。
圖1：N3-kethoxal分子及其特性
Keth-seq作為在全轉錄組鑑定RNA二級結構的新方法，具有較高的特異性，其修飾鹼基中鳥嘌呤的比例遠遠高於其他鹼基且在重複樣本之間具有高度的一致性【圖2a】。與已知的其他技術比如icSHAPE相比，兩者在整體檢測到的鳥嘌呤的結構信號分佈上具有很高的相關性【圖2b】。在一些已知結構的RNA上，Keth-seq檢測到的結構信號與真實結構更加吻合【圖2c】。在與DMS-seq的比較中，Keth-seq也達到了相似的檢測準確性水平【8】。因此，Keth-seq作為一個新方法，其結構檢測的準確性可以達到或者超過當前的類似技術。
圖2：Keth-seq及在rG4區域附近的信號
Keth-seq特異檢測鳥嘌呤結構信號的特點可用於RNA G-四鏈體（RNA G-quadruplexes，rG4）的探測。之前的研究發現rG4結構廣泛的存在於體外（in vitro）哺乳動物RNA中。rG4在加入PDS的條件下更加穩定，但是在體內（in vivo）條件下rG4存在與否存在爭議【9，10】。作者首先比較了in vitro條件下，+PDS樣本和-PDS樣本在已知的in vitro rG4區域的結構。發現在+PDS樣本中，這些區域的基尼係數（GINI index，值越大，結構值分佈越不均勻，結構越多）更大，具有更多的結構【圖2d】。同樣的，在in vivo條件下，這些已知的rG4區域在+PDS樣本也是具有更多的結構，表明它們在in vivo條件下也可能形成rG4結構【圖2d，2e】。
綜上所述，Keth-seq採用的分子具有更高的特異性和修飾效率，在結構探測上得到了和其他技術類似水平或者更好的效果。特異性的鳥嘌呤修飾使得該技術可用於G富集的序列的結構測定，比如不同條件下的rG4結構等。
據悉，芝加哥大學的何川教授、武漢大學周翔教授和清華大學張強鋒教授為本文的通訊作者，武漢大學翁小成教授、清華大學博士生龔警、武漢大學博士生陳毅、芝加哥大學博士生吳桐為本文共同第一作者。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41589-019-0459-3
製版人：小嫻子
參考文獻
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9. Kwok CK, Marsico G, Sahakyan AB, Chambers VS, Balasubramanian S.rG4-seq reveals widespread formation of G-quadruplex structures in the humantranscriptome. Nature methods 2016;13(10):841.
10. Guo JU, Bartel DP. RNA G-quadruplexes are globally unfolded ineukaryotic cells and depleted in bacteria. Science 2016;353(6306):aaf5371.
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