撰文 | 雪月
隨著科研中對流式檢測的需求越來越高，擴展熒光染料可用種類也相應得到發展。擴展可用熒光染料範圍的主要方法是將串聯共軛物添加到現有的一級熒光團上（如APC熒光團與Cy7綴合物串聯產生APC-Cy7）。串聯共軛物通過其一級熒光團的共振能量轉移（Forster resonance energy transfer FRET）激活，改變一級熒光團的發射光譜。串聯熒光團的應用為定義更多細胞群提供便利，以至於它們現在已成為開發合適的流式細胞儀考慮的因素之一，特別是隨著檢測> 30種不同熒光團的流式細胞儀的出現。
但是串聯染料會發生降解或者失去FRET能力，從而導致變成一級熒光光譜發射，如APC-Cy7降解為APC。串聯降解是一種公認現象。已經有些研究探索不同染色條件對串聯染料穩定性的影響，如溫度、光照、固定條件、血清等。
串聯熒光染料降解示意圖
近日，來自美國愛荷華大學的Vladimir Badovinac在Immunity上發表題為 Worry and FRET: ROS Production Leads to Fluorochrome Tandem Degradation and impairs Interpretation of Flow Cytometric Results 的文章。該文章指出ROS會引起串聯熒光染料降解，對流式細胞術結果的分析產生較大影響。而在染色緩衝液中加入還原劑則能抑制熒光染料串聯降解。
作者發現他們在進行盲腸結紮和穿刺誘導的膿毒症模型（cecal ligation and puncture CLP）時，當使用串聯染料時，相較於對照組（sham /control），會出現多個細胞亞群。作者認為染色緩衝液中某些物質會導致串聯降解，而且這種現象隨著粒細胞數量增加變得更明顯。經過探究作者發現在染色緩衝液中的氧化劑如加入H2O2能促進串聯降解，而加入還原劑如2-巰基乙醇 BME或者維生素C則能夠抑制。這也與粒細胞產生過多ROS一致。
APC-efluor780串聯降解導致在APC通道中可檢測到APC信號
為了確定在其他炎性感染疾病的分析中是否也存在這個現象，作者用感染了非致死性的約氏瘧原蟲17XNL（PyXNL）（瘧疾）或李斯特菌單核細胞增生症-兩種引起強烈ROS產生的感染疾病模型驗證發現，ROS確實能夠引起熒光染料串聯降解。
接下來作者在染色緩衝液中加入還原劑以抑制串聯降解。一個是在染色緩衝液中加入BME，選擇BME是因為它在完全培養基配方中會使用。另一種是維生素C。還原劑的添加能夠限制串聯熒光染料的降解，而不會對對照產生不利影響。
但是，作者指出他們還沒有詳盡列出其他有助於控制串聯染料降解的修飾物質。而且他們的評估不能區分是串聯染料的脫離還是僅僅破壞串聯的FRET能力。以後研究此機制的工作可能會允許創建更好的穩定的熒光染料，以最大程度地減少此類干擾結果穩定性的問題。
原文鏈接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1074761320300741?via%3Dihub
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