導讀
在妊娠11-14周時，人胎兒小腸黏膜免疫系統就已發育成熟，但子宮內是否存在活菌，以及是否與腸道免疫系統相互作用尚不清楚。通過掃描電鏡（n=4）在妊娠中期人胎胎糞囊中發現細菌樣形態，並通過16S rRNA測序（n=40/50）與環境對照（n=87）相比檢測到稀疏的細菌信號。胎兒胎糞中富集了18個類群，其中其中微球菌科（n=9）和乳酸桿菌科（n=6）最為豐富。以微囊藻科為主的胎兒小腸顯示出明顯的T細胞組成和上皮轉錄模式。僅在單核細胞存在下分離的胎兒滕黃微球菌在胎盤激素上生長，在抗原提呈細胞內仍然存活，體外炎症有限，並具有與胎兒存活相關的基因組特徵。因此，在妊娠中期，活菌在胎兒腸內非常有限，儘管在亞組標本中檢測到具有免疫調節能力的菌株。
論文ID
原名：Viable bacterial colonization is highly limited in the human intestine in utero
譯名：子宮內胎兒腸道內活菌定殖非常有限
期刊： Nature Medicine
IF：30.641
發表時間：2020.02.24
作者單位：美國加利福尼亞大學醫學部胃腸科
實驗設計
本文首先通過掃描電子顯微鏡觀察終止妊娠來源的孕中期胎兒（妊娠中位週數20±2.2周）小腸粘膜胎糞，發現其存在細菌樣結構，表明孕中期的人類胎兒腸道內存在很有限的細菌；通過16S rRNA測序的方法（V4可變區）檢測出不同於環境對照的少量細菌信號，18個細菌類群在胎糞中富集，微球菌科和乳桿菌屬丰度最高。此外，通過模擬胎兒腸道環境的培養條件（添加胎盤類固醇激素(1*10−5M孕酮, 1* 10−6M 17β-雌二醇)，或THP1人類單核細胞，MOI值=10），從胎糞中分離出了一種優勢細菌菌株，並通過全基因組測序比對確定為Micrococcus luteus（藤黃微球菌）。為了胎兒腸道免疫環境是否與觀察到的胎糞變化有關，從胎兒的胃到盲腸的連續切片分離免疫細胞，採用酶消化的方案（用新鮮製備的1 mg/ml膠原酶IV和10 mg/ml DNAse在37°C的cRPMI培基中消化30分鐘，在200 r.p.m.的振盪水浴中分離獲得LP細胞）。腸繫膜淋巴結和脾細胞在如上所述的膠原酶IV培養基中消化30分鐘，然後通過70μm過濾器。通過流式細胞術對免疫細胞進行鑑定以及分型，並結合免疫譜數據觀察到胎兒腸道菌群對免疫細胞的募集和調節的影響，發現M.luteus誘導了免疫耐受，該菌呈現適應胎兒環境的特徵，可在腸道抗原呈遞細胞中存活，並有限制炎症反應的能力。
結果
為了確定子宮內腸道是否存在細菌，我們首先對終止妊娠的人胎兒腸道進行直接可視化（妊娠中位週數20±2.2周）。迴腸末段固定，薄切片，光鏡觀察。胎兒迴腸5μm段真細菌熒光原位雜交顯示極為稀疏的細菌信號（擴展數據1a-c）。由於光鏡所需的薄切片進一步稀釋了罕見的信號，因此對四個獨立的胎兒迴腸末端標本進行了掃描電子顯微鏡（SE）顯微鏡檢查；在處理前通過結紮腸段將環境暴露降至最低（圖1a）。在四個獨立的胎兒標本中的三個（圖1b，c；標本1-3），在形態上和比例上與細菌球菌一致的緊密排列的細胞結構簇被觀察到在胎糞的離散、孤立的小囊中，深深地嵌入在原位的現有粘蛋白結構中（圖1b）。從暴露的上皮細胞結構可以看出，標本4的腔中胎糞有限；在該標本中沒有觀察到成簇的球菌（圖1c）。證實了細菌對胎糞的局部作用，在上皮下區域，如固有層或肌層，沒有觀察到這些球狀結構（圖1c（iv））。因此，在人類的中期妊娠，在胎兒腸胎糞的孤立小囊中嵌入了與球形細菌形態一致的離散的細胞結構。
我們建立了一個人類胎兒小腸胎糞庫（50個胎兒標本；149個標本，87個技術和臨床對照品；補充圖1，補充表1），用於分子技術鑑定細菌。無論小腸段取樣情況如何，與我們的SE顯微鏡觀察結果一致，胎兒胎糞中16S rRNA拷貝數的總細菌負荷較低且可變，但明顯高於提取緩衝液、程序性拭子、醫院房間空氣拭子，空白棉籤或胎兒腎臟對照組（13個胎糞樣本中有9個樣本大於對照組第75百分位16srRNA拷貝數；擴展數據1d，e）。這些數據表明，細菌的存在，如果有的話，是極低的，接近分子檢測的極限。為了增強V4 16S rRNA基因擴增前的細菌信號，使用Cas9靶向（雜交去除豐富序列（DASH））；去除人線粒體16srdna（mtDNA）；這並沒有改變檢測到的與條帶選擇和凝膠提取相比的細菌（擴展數據2a-c）。在16srRNA環境和程序汙染控制數據集（補充表1和表2）中，在50個胎兒標本中的40個標本中鑑定出了一個簡單的細菌圖譜，平均值為23.5個操作分類單位（OTU），每個標本的序列讀取計數≥5次（補充表1和表2以及擴展數據3a）。在胎兒標本（108個樣品；線性混合效應（LME）P=0.78；擴展數據3b）中，沿著腸長度的複製樣品中的細菌分佈是一致的，樣品間的分佈距離大於樣品內的距離，這表明由於均勻汙染不太可能檢測到信號（擴展數據3c）。因此，隨後的分析集中在小腸的中段（n=40）。
圖1. 胎兒胎糞中罕見的細菌結構（掃描電子顯微鏡）。
與程序性拭子和腎臟對照組相比，18個分類群在胎兒胎糞中顯著富集（DESeq2；log2FC≥2，假髮現率（FDR）<0.05）（圖1d）。明顯的細菌分佈特徵由檢測到的優勢生物確定（PERMANOVA，R2=0.18，P=1×10-5；圖2a）。乳酸桿菌（OTU12）和微球菌科（OTU10）代表了相對丰度最高的兩個胎兒胎糞分類群（擴展數據3d）和不同樣本子集內的優勢分類群（即，在給定樣本中，讀取16srRNA比例最大的OTU是Lactobacillus-meconium（胎糞乳桿菌，LM），n=6或Micrococcaceae-meconium（微囊胎糞，MM），n=9；擴展數據3e）。其餘樣本以其他細菌分類群（其他胎糞，n=25）為主，包括乳酸桿菌和微球菌科內的不同分類群，以及Bacteroides（擬桿菌），Bifidobacterium（雙歧桿菌）和Prevotella（普雷沃菌）（擴展數據3e）。OM樣本代表了研究的大多數胎糞，其16S rRNA圖譜與生物汙染對照組相似（程序性拭子和胎兒腎臟；擴展數據3f，g）。只有LM和MM樣本（n=15）顯示出與OM樣本、程序和腎臟對照組（PERMANOVA，R2=0.167，P=1×10-5；擴展數據3f-h）和各種技術對照組（n=48，擴展數據3i）顯著不同的細菌分佈。使用嚴格的閾值（decontam R pack age；P threshold=0.6，補充表3）未將乳桿菌OTU12和微球菌科OTU10識別為汙染物。因此，在妊娠的這一階段，大多數人胎兒腸道樣本產生的信號可能是由於極低負荷樣本中與分子檢測方法相關的噪聲和/或細菌缺乏所致。儘管如此，對球菌樣的結構的原位鑑定以及對大約30%的胎兒腸道標本產生不同於生物和技術對照的細菌圖譜的觀察，使我們得以確定胎兒腸道免疫環境是否與觀察到的胎糞變化有關。
利用標本採集時產生的腸道免疫譜數據，我們檢測了固有層（LP）T細胞與胎糞16S rRNA數據（n=22）的組成。證實最近的發現，與腸繫膜淋巴結和脾臟相比，PLZF+CD161+ CD4+ Vα7.2-TCR-αβ+T細胞在胎兒LP中高度相鄰（補充圖2和擴展數據4a）。我們注意到胎糞細菌與LP PLZF+CD161+T細胞之間存在顯著關係（PERMANOVA，R2=0.11，P=0.0004，圖2b）。PLZF+CD161+ T細胞比例最高的LP樣本與以MM為主的胎糞相關（圖2b），MM樣本的PLZF+CD161+T細胞比例明顯高於所有其他樣本（圖2c和擴展數據4b，c）。
胎兒腸道記憶T細胞，其中大多數表達PLZF和CD161，最近有報道支持上皮幹細胞功能。因此，我們分析了與MM相關的成對上皮細胞層轉錄組與其他標本的比較（分別為n=7，n=6）。MM相關上皮（MM-E）樣品顯示出明顯的轉錄程序，從胎糞樣本（以所有其他分類群為主）（PERMANOVA，P=0.02 R2=0.16，圖2d-g）和LM相關上皮（LM-E）（n=3）和OM相關上皮（OM-E）（n=3）組（擴展數據4d）。基因集富集分析確定與腸上皮幹細胞、轉運擴增細胞和分泌祖細胞相關的基因富集於MM-E（例如LGR5、SOX9、NOTCH1和NOTCH4；圖2g、h和補充表4），符合胎兒記憶T細胞促進上皮幹細胞功能的能力。MUC3A在MM-E中下調（圖2f），但與Toll樣受體（TLR）信號傳導（NFKB2和TNFSF15）、吞噬功能（NOS2）、免疫細胞化學吸引（CXCL1-3和CCL20）和巨噬細胞抑制（CD200；圖2f-h）相關的轉錄本增加（圖2f-h和補充表4）。這些轉錄本表明，在存在微球菌科OTU10的樣本中，在營養有限的腸道生態位背景下，免疫細胞招募和調節的程序是不同的。
圖2. 不同免疫細胞表型與胎兒胎糞中微球菌相關富集有關
為了確定腸道微球菌科是否可行，我們嘗試從冷凍保存的MM胎兒胎糞樣本中分離出該分類群的最高讀取計數。微球菌科分離物不能用傳統的選擇性培養基回收，只能在模擬胎兒腸道環境的培養條件下獲得（補充表5），包括添加胎盤類固醇激素或THP1人類單核細胞，提示它們可能代表子宮內的微生物選擇壓力。用這些培養方法或傳統的選擇培養基不能從MM樣品中培養乳酸桿菌。利用全長16sr RNA序列和SILVA數據庫（補充表5），將從單細胞共培養物中分離出的胎兒細菌分類為微球菌。在單核細胞存在的情況下也分離出其他物種（補充表5）。與OTU10的16sr RNA V4區域同源性最高的胎兒分離物（97%）被用於進一步研究（Micro36，圖3a，擴展數據5和補充表5）。
我們假設，在模擬子宮腸道環境的培養條件下，胎兒Micrococcus luteus（藤黃微球菌）比親緣系統發育的微球菌表現出更大的適應優勢。因此，我們在孕酮和/或β-雌二醇的妊娠晚期臍血濃度達到峰值時，檢測了其生長情況以及兩個參考菌株MicroRef1（美國型培養物收集（ATCC）4698）和MicroRef2（ATCC 12698）的生長情況。Micro36在碳限制培養基中表現出獨特的孕酮和β-雌二醇生長能力，儘管細胞密度較低（圖3b和擴展數據6a，b）。在富含碳的條件下，與之前報道的類固醇激素的抑菌作用一致，孕酮和β-雌二醇（但不是單獨的β-雌二醇）普遍抑制了所有三株藤黃微球菌的生長（圖3b和擴展數據6c-f）。這些數據表明，低營養基質利用率和妊娠激素的條件允許特定胎兒細菌菌株的有限生長，為人類妊娠期間腸道細菌負荷的控制提供瞭解釋。
單核細胞在分離初始微球菌中的必要性（補充表5）表明其在吞噬細胞內生存的能力。將分離的人胎腸原代HLA-DR+抗原呈遞細胞（APCs）清除胞內細菌，並與分離的胎兒微球菌孵育，進行吞噬試驗和慶大黴素保護試驗。在24小時時， 1×107菌落形成單位（c.f.u.）ml-1的Micro 36被重新記錄，並且胎兒分離物在48小時時在1×106c.f.u.ml-1的APCs中保持存活（圖3c），表明細胞內存活時間延長。對照參考菌株MicroRef1和MicroRef2在可比條件下（圖3c）在較小程度上不可行。使用帶有額外大腸桿菌對照（擴展數據6g）的RAW264.7巨噬細胞係獲得類似結果，並且在這兩個實驗的時間過程中（擴展數據6h，i）未產生慶大黴素抗性。這種胎兒微球菌菌株在吞噬細胞內的存活能力提供了保護進入胎兒腸道的潛在機制。
Micro36的全基因組測序（補充表6）允許對分離物進行高分辨率分類，並在與系統發生學親屬比較時確定了共享和獨特的基因組特徵。Micro36的全基因組平均核苷酸同源性（ANI）為96.9%，由全基因組ANI與其他人類菌種進行聚類，但不包括環境中的M.luteus分離株（圖3d和補充表7）。對我們的胎兒微球菌和所有可用微球菌基因組進行全基因組分析，確定了用於構建高分辨率系統發育的共享單拷貝基因（擴展數據7）（相關分支的bootstrap值為1，圖3e）。使用96.5%的ANI物種形成切斷，Micro36被歸類為一株M.luteus。
與M.luteus（MicroRef1）相比，Micro36顯示了425個獨特的基因，其中256個被註釋（補充表8）。Micro36的基因組特徵包括兩個固醇載體蛋白和一個假定的甾體酮異構酶，這通常有助於甾體激素的去乙酰化。基因組還編碼兒茶酚途徑中的活性氧和氮自由基還原酶和基因。雖然這些基因的廣泛流行尚待確定，但這些數據提供了可能的機制，Micro36可以在胎盤激素上生長（圖3b），在吞噬細胞中保持存活（圖3c），在缺氧條件下與MM相關上皮中NOS2升高相關（圖2f）。
圖3. 從胎兒胎糞中分離的微球菌對胎兒環境有適應性
為了確定是否在產後嬰兒樣本中發現了M.luteus分離物，我們利用了來自三個獨立的早期生活同居者的公共可用16S rRNA數據。序列顯示與我們的胎兒分離物在整個早期（12個月以內；補充表9）中檢測到≥97%的同源性；但是，同源性最高的序列（≥99%，補充表9）主要出現在嬰兒胎糞（第一次大便）樣本中（擴展數據8a）。M.luteus在嬰兒樣本中含量較低，但在兩個獨立的代謝組26,27（擴展數據8b，c）中在產後胎糞中含量最高。這些物種在分娩時在母體胸部和陰道口中被檢測到，並且在母體大便中含量不高（擴展數據8b，c）。在我們的胎兒胎糞樣本中，當考慮所有樣本時，每個樣本中檢測到的OTU數量和微球菌科OTU10的相對丰度均與胎齡無關（擴展數據8d，e）。然而，在MM組中，OTU10相對丰度與胎齡之間存在明顯的正相關（Pearson's r=0.5，P=0.1；擴展數據4f）。這表明腸道Micro36或高度相關的菌株可能在妊娠期間增加，至少持續到出生，並可能在出生後通過系統發育相關的物種獲得成功。
MM與胎兒上皮基因表達的不同程序相關（圖2）。因此，我們通過分析體外暴露於Micro36 4h的原代人胎兒腸上皮細胞（n=2）的轉錄組，檢測了胎兒M.luteus誘導特徵性特徵的能力。當Micro36暴露的上皮細胞與培養基對照組比較時，觀察到轉錄差異（圖4a）。正如預期的那樣，短期暴露於體外浮游細菌培養物並不能完全重現在MM-E中觀察到的胎兒腸道轉錄體模式（圖4a）。儘管如此，微生物暴露誘導TLR6的表達，其下游調節因子NKFB在MM-E中富集（圖4a，b）。這些數據表明，即使在短期的胎兒細菌暴露後，胎兒小腸上皮細胞對微球菌也表現出跨膜反應，部分地再現了在MM-E中觀察到的特徵。
免疫細胞募集和調節介質在MM-E中的高表達（圖2f）導致我們評估Micro36影響從脾臟獲得的主要胎兒HLA-DR+ APC功能的能力（補充圖3）。在不降低細胞活力的情況下（擴展數據9a），Micro36和兩個參考菌株誘導胎兒產生與腸巨噬細胞（粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和G-CSF）以及白細胞介素（IL）-10（圖4c-e）成熟相關的細胞因子，促進免疫耐受性環境。與參考菌株相比，Micro36誘導的腫瘤壞死因子（TNF）-α水平較低，表明其限制APC炎症的能力（圖4f）。LLT1是胎兒特異性抑制性C型凝集素CD161的天然配體，在胎兒腸道巨噬細胞上表達，可在APCs的TLR激活時誘導表達。考慮到胎兒M.luteus在體外誘導胎兒上皮細胞TLR6的能力，我們檢測了它是否能誘導人胎脾原發性APCs上的LLT1表達。與系統發育相關的菌株相比，只有胎兒Micro36誘導了LLT1的表達，並且與感染的多樣性成比例，儘管低於LP-APCs體外觀察到的水平（圖4g-i）。
圖4. 胎兒微球菌分離物在體外促進免疫耐受表型
由於結紮（ligation）CD161抑制胎兒腸道PLZF+CD161+ T細胞產生IFN-γ，我們推測Micro36可能特異性地調節這些T細胞的炎性潛能。經Micro36或MicroRef1預處理的分類脾APC（擴展數據9b）與自體、胎兒腸效應記憶T細胞（純度>99%）共孵育，其中大部分表達PLZF和CD161（擴展數據9c，d）。與3d後的MicroRef1相比，Micro36暴露導致這些T細胞產生IFN-γ的顯著減少（圖4j），表明胎兒M.luteus誘導了免疫耐受。在影響PLZF+ T細胞功能的同時，Micro36對這些細胞或調節性T細胞的比例積累沒有影響（擴展數據9e，f）且在APC T細胞共培養5d後不影響IL-17A、IL-17F、GM-CSF、IL-4、IL-10、IL-13或TNF-α的產生（擴展數據9g-m）。總之，這些數據表明，胎兒腸道免疫細胞能夠對細菌產生炎症反應，而胎兒M.luteus可能通過誘導耐受性APCs和抑制胎兒記憶T細胞產生IFN-γ來繞過這一點。
討論
子宮內是否存在細菌是有爭議的，因為通常用於低負荷環境中細菌鑑定的分子方法固有的侷限性。當細菌負荷極低時，背景噪聲和假陽性在技術陰性對照中很常見，因此，簡單地去除這些對照中檢測到的所有分類群並不合適。在我們的研究中，儘管改進了現有的促進細菌信號的分子方法，但16S rRNA測序數據仍然存在噪聲，並且在大多數樣本（70%）中識別出了一個與程序性或胎兒腎臟控制不明顯的稀疏細菌信號。使用一種分類單元過濾方法，集中於在大多數陰性對照中檢測到的信號，導致將一個微球菌分類單元識別為在胎糞樣本中富集的少量盤狀無生命分類單元之一。利用這些分子數據作為胎兒細菌物種分離的指南，我們隨後從平行保存的樣品中培養藤黃微球菌，這些樣品在樣品處理過程中從未遇到過提取緩衝液。分子細菌信號比顯微鏡下鑑定的信號要稀疏得多，這表明我們去除汙染分類群可能抑制了更廣泛的細菌信號，並支持以前關於緩衝液控制中汙染分類群假陽性分類的報道。我們的分子數據在50份胎兒腸道樣本中僅發現17個不可歸因於汙染的額外分類群，這表明胎兒腸道中的條件高度限制了細菌，其機制值得進一步研究。
雖然在低負荷細菌環境中處理汙染的最佳方法存在爭議，但我們的數據表明，目前的分子方法本身不足以支持或拒絕子宮內不育假說。通過結合分子細菌檢測、免疫相關、顯微鏡觀察、菌株分離和離體實驗，我們的研究為妊娠中期人類胎兒腸道中存在稀疏但有活力的細菌提供了直接和間接的證據，並能通過胎兒免疫限制炎症潛能細胞群。有可能是本研究中未調查的汙染源產生的細菌信號，但據我們判斷，確鑿的證據表明，限制細菌進入人類胎兒腸道並不是絕對的。我們注意到，由於缺乏與我們隊列中的樣本相關的臨床數據（根據我們的制度協議確定的男性年齡），限制了我們檢查與微球菌鑑定相關的妊娠特徵的能力，這是後續研究的一個重要考慮因素。
胎兒微球菌最有可能來自母體宮頸陰道微生物群，通常是這個屬。雖然我們的胎兒微球菌分離物顯示出與迷走神經微球菌分離物相似的基因組，但它也編碼了在這些菌株中未發現的菌株特異性基因，這可能在胎兒腸道的強選擇性條件下提供生存優勢。事實上，胎兒M.luteus編碼一種可能參與類固醇代謝的酮異構酶，在低營養條件下，在孕酮和β-雌二醇存在下表現出獨特的生長受限能力。這一觀察結果加上M.luteus在飢餓條件下可以以休眠、存活但不可培養的狀態存在，可能允許它在營養有限和胎兒腸道中暴露妊娠激素的條件下持續存在。與這一假設一致，腸上皮轉錄組分析顯示，在發現滕黃微球菌的胎兒樣本中，微生物營養基質（包括粘蛋白糖蛋白MUC3A）的表達較低。總的來說，這些觀察結果為檢測胎兒腸道樣本中的滕黃微球菌特異性亞群提供了一個潛在的解釋，在這些亞群中，營養限制和妊娠激素的普遍條件可能導致M.luteus的有限存在。
細菌的存在可能在中晚期並不普遍，但在我們的研究中，微球菌與腸上皮和LP記憶T細胞室的免疫狀態有關。胎兒腸道中的微球菌調節黏膜免疫，免疫系統反過來影響宿主所能耐受的微生物。因此，似乎可以為特定的M.luteus種屬另外選擇上皮免疫和LP免疫。反過來，微球菌限制了這些細胞的致炎能力，這可能會培養一個允許其在子宮內存活的耐受環境。然而，我們認識到其他發育因素，如干細胞生態位、胎兒T細胞發育為調節性T細胞的傾向和吞食羊水的抗原，也影響產前免疫。
最近對胎兒免疫的研究提出了一種假設，即子宮內的細菌信號會引發一種適應性免疫反應，包括T細胞活化。胎兒T細胞對非感染的母體和自身抗原有反應，並能在腸內形成記憶。胎兒腸道中存在的細菌表明，細菌抗原也可能有助於T細胞的活化，因為胎兒腸道T細胞並不完全表現出耐受性表型。它們在沒有全身炎症的情況下產生炎性細胞因子的能力表明子宮內免疫反應的腸道比較，這可能對胎兒腸道細菌的耐受或清除至關重要。胎兒腸道微球菌增多與產生IFN-γ的粘膜記憶PLZF+CD161+ T細胞比例增加有關，只有胎兒微球菌分離出這些T細胞減少IFN-γ的產生。雖然胎兒微球菌可能引起許多反應，但在APCs上特異性地誘導LLT1識別了一種潛在的免疫調節機制，這是胎兒適應性免疫所獨有的。因此，對胎兒微球菌的免疫記憶始於子宮。
胎兒腸道如何限制細菌的存在尚不清楚，儘管在妊娠激素存在和吞噬細胞內，特定細菌在營養限制條件下的生存能力為子宮內的生存提供了可能的機制。子宮內細菌相互作用或缺乏這種相互作用對長期健康的影響仍有待確定。
評論
腸道菌群在免疫發育過程中有重要作用。在妊娠早期，胎兒的腸粘膜免疫就已經開始發育，然而目前尚不清楚子宮內是否存在活菌與胎兒的腸道免疫系統互作。Nature Medicine發表的這一項最新研究，用掃描電子顯微鏡和16S rRNA測序表明，孕中期的人類胎兒腸道內存在很有限的細菌，並分離出其中的一種優勢細菌（Micrococcus luteus，藤黃微球菌）。該菌表現出對子宮內胎兒腸道環境的適應性，並在體外呈現免疫調節活性，可能對胎兒腸道免疫發育有潛在調控作用。這些發現拓展了人們對生命早期腸道菌群定殖、菌群對免疫發育的影響的認知，值得進一步驗證和研究。
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