导读
在妊娠11-14周时，人胎儿小肠黏膜免疫系统就已发育成熟，但子宫内是否存在活菌，以及是否与肠道免疫系统相互作用尚不清楚。通过扫描电镜（n=4）在妊娠中期人胎胎粪囊中发现细菌样形态，并通过16S rRNA测序（n=40/50）与环境对照（n=87）相比检测到稀疏的细菌信号。胎儿胎粪中富集了18个类群，其中其中微球菌科（n=9）和乳酸杆菌科（n=6）最为丰富。以微囊藻科为主的胎儿小肠显示出明显的T细胞组成和上皮转录模式。仅在单核细胞存在下分离的胎儿滕黄微球菌在胎盘激素上生长，在抗原提呈细胞内仍然存活，体外炎症有限，并具有与胎儿存活相关的基因组特征。因此，在妊娠中期，活菌在胎儿肠内非常有限，尽管在亚组标本中检测到具有免疫调节能力的菌株。
论文ID
原名：Viable bacterial colonization is highly limited in the human intestine in utero
译名：子宫内胎儿肠道内活菌定殖非常有限
期刊： Nature Medicine
IF：30.641
发表时间：2020.02.24
作者单位：美国加利福尼亚大学医学部胃肠科
实验设计
本文首先通过扫描电子显微镜观察终止妊娠来源的孕中期胎儿（妊娠中位周数20±2.2周）小肠粘膜胎粪，发现其存在细菌样结构，表明孕中期的人类胎儿肠道内存在很有限的细菌；通过16S rRNA测序的方法（V4可变区）检测出不同于环境对照的少量细菌信号，18个细菌类群在胎粪中富集，微球菌科和乳杆菌属丰度最高。此外，通过模拟胎儿肠道环境的培养条件（添加胎盘类固醇激素(1*10−5M孕酮, 1* 10−6M 17β-雌二醇)，或THP1人类单核细胞，MOI值=10），从胎粪中分离出了一种优势细菌菌株，并通过全基因组测序比对确定为Micrococcus luteus（藤黄微球菌）。为了胎儿肠道免疫环境是否与观察到的胎粪变化有关，从胎儿的胃到盲肠的连续切片分离免疫细胞，采用酶消化的方案（用新鲜制备的1 mg/ml胶原酶IV和10 mg/ml DNAse在37°C的cRPMI培基中消化30分钟，在200 r.p.m.的振荡水浴中分离获得LP细胞）。肠系膜淋巴结和脾细胞在如上所述的胶原酶IV培养基中消化30分钟，然后通过70μm过滤器。通过流式细胞术对免疫细胞进行鉴定以及分型，并结合免疫谱数据观察到胎儿肠道菌群对免疫细胞的募集和调节的影响，发现M.luteus诱导了免疫耐受，该菌呈现适应胎儿环境的特征，可在肠道抗原呈递细胞中存活，并有限制炎症反应的能力。
结果
为了确定子宫内肠道是否存在细菌，我们首先对终止妊娠的人胎儿肠道进行直接可视化（妊娠中位周数20±2.2周）。回肠末段固定，薄切片，光镜观察。胎儿回肠5μm段真细菌荧光原位杂交显示极为稀疏的细菌信号（扩展数据1a-c）。由于光镜所需的薄切片进一步稀释了罕见的信号，因此对四个独立的胎儿回肠末端标本进行了扫描电子显微镜（SE）显微镜检查；在处理前通过结扎肠段将环境暴露降至最低（图1a）。在四个独立的胎儿标本中的三个（图1b，c；标本1-3），在形态上和比例上与细菌球菌一致的紧密排列的细胞结构簇被观察到在胎粪的离散、孤立的小囊中，深深地嵌入在原位的现有粘蛋白结构中（图1b）。从暴露的上皮细胞结构可以看出，标本4的腔中胎粪有限；在该标本中没有观察到成簇的球菌（图1c）。证实了细菌对胎粪的局部作用，在上皮下区域，如固有层或肌层，没有观察到这些球状结构（图1c（iv））。因此，在人类的中期妊娠，在胎儿肠胎粪的孤立小囊中嵌入了与球形细菌形态一致的离散的细胞结构。
我们建立了一个人类胎儿小肠胎粪库（50个胎儿标本；149个标本，87个技术和临床对照品；补充图1，补充表1），用于分子技术鉴定细菌。无论小肠段取样情况如何，与我们的SE显微镜观察结果一致，胎儿胎粪中16S rRNA拷贝数的总细菌负荷较低且可变，但明显高于提取缓冲液、程序性拭子、医院房间空气拭子，空白棉签或胎儿肾脏对照组（13个胎粪样本中有9个样本大于对照组第75百分位16srRNA拷贝数；扩展数据1d，e）。这些数据表明，细菌的存在，如果有的话，是极低的，接近分子检测的极限。为了增强V4 16S rRNA基因扩增前的细菌信号，使用Cas9靶向（杂交去除丰富序列（DASH））；去除人线粒体16srdna（mtDNA）；这并没有改变检测到的与条带选择和凝胶提取相比的细菌（扩展数据2a-c）。在16srRNA环境和程序污染控制数据集（补充表1和表2）中，在50个胎儿标本中的40个标本中鉴定出了一个简单的细菌图谱，平均值为23.5个操作分类单位（OTU），每个标本的序列读取计数≥5次（补充表1和表2以及扩展数据3a）。在胎儿标本（108个样品；线性混合效应（LME）P=0.78；扩展数据3b）中，沿着肠长度的复制样品中的细菌分布是一致的，样品间的分布距离大于样品内的距离，这表明由于均匀污染不太可能检测到信号（扩展数据3c）。因此，随后的分析集中在小肠的中段（n=40）。
图1. 胎儿胎粪中罕见的细菌结构（扫描电子显微镜）。
与程序性拭子和肾脏对照组相比，18个分类群在胎儿胎粪中显著富集（DESeq2；log2FC≥2，假发现率（FDR）<0.05）（图1d）。明显的细菌分布特征由检测到的优势生物确定（PERMANOVA，R2=0.18，P=1×10-5；图2a）。乳酸杆菌（OTU12）和微球菌科（OTU10）代表了相对丰度最高的两个胎儿胎粪分类群（扩展数据3d）和不同样本子集内的优势分类群（即，在给定样本中，读取16srRNA比例最大的OTU是Lactobacillus-meconium（胎粪乳杆菌，LM），n=6或Micrococcaceae-meconium（微囊胎粪，MM），n=9；扩展数据3e）。其余样本以其他细菌分类群（其他胎粪，n=25）为主，包括乳酸杆菌和微球菌科内的不同分类群，以及Bacteroides（拟杆菌），Bifidobacterium（双歧杆菌）和Prevotella（普雷沃菌）（扩展数据3e）。OM样本代表了研究的大多数胎粪，其16S rRNA图谱与生物污染对照组相似（程序性拭子和胎儿肾脏；扩展数据3f，g）。只有LM和MM样本（n=15）显示出与OM样本、程序和肾脏对照组（PERMANOVA，R2=0.167，P=1×10-5；扩展数据3f-h）和各种技术对照组（n=48，扩展数据3i）显著不同的细菌分布。使用严格的阈值（decontam R pack age；P threshold=0.6，补充表3）未将乳杆菌OTU12和微球菌科OTU10识别为污染物。因此，在妊娠的这一阶段，大多数人胎儿肠道样本产生的信号可能是由于极低负荷样本中与分子检测方法相关的噪声和/或细菌缺乏所致。尽管如此，对球菌样的结构的原位鉴定以及对大约30%的胎儿肠道标本产生不同于生物和技术对照的细菌图谱的观察，使我们得以确定胎儿肠道免疫环境是否与观察到的胎粪变化有关。
利用标本采集时产生的肠道免疫谱数据，我们检测了固有层（LP）T细胞与胎粪16S rRNA数据（n=22）的组成。证实最近的发现，与肠系膜淋巴结和脾脏相比，PLZF+CD161+ CD4+ Vα7.2-TCR-αβ+T细胞在胎儿LP中高度相邻（补充图2和扩展数据4a）。我们注意到胎粪细菌与LP PLZF+CD161+T细胞之间存在显著关系（PERMANOVA，R2=0.11，P=0.0004，图2b）。PLZF+CD161+ T细胞比例最高的LP样本与以MM为主的胎粪相关（图2b），MM样本的PLZF+CD161+T细胞比例明显高于所有其他样本（图2c和扩展数据4b，c）。
胎儿肠道记忆T细胞，其中大多数表达PLZF和CD161，最近有报道支持上皮干细胞功能。因此，我们分析了与MM相关的成对上皮细胞层转录组与其他标本的比较（分别为n=7，n=6）。MM相关上皮（MM-E）样品显示出明显的转录程序，从胎粪样本（以所有其他分类群为主）（PERMANOVA，P=0.02 R2=0.16，图2d-g）和LM相关上皮（LM-E）（n=3）和OM相关上皮（OM-E）（n=3）组（扩展数据4d）。基因集富集分析确定与肠上皮干细胞、转运扩增细胞和分泌祖细胞相关的基因富集于MM-E（例如LGR5、SOX9、NOTCH1和NOTCH4；图2g、h和补充表4），符合胎儿记忆T细胞促进上皮干细胞功能的能力。MUC3A在MM-E中下调（图2f），但与Toll样受体（TLR）信号传导（NFKB2和TNFSF15）、吞噬功能（NOS2）、免疫细胞化学吸引（CXCL1-3和CCL20）和巨噬细胞抑制（CD200；图2f-h）相关的转录本增加（图2f-h和补充表4）。这些转录本表明，在存在微球菌科OTU10的样本中，在营养有限的肠道生态位背景下，免疫细胞招募和调节的程序是不同的。
图2. 不同免疫细胞表型与胎儿胎粪中微球菌相关富集有关
为了确定肠道微球菌科是否可行，我们尝试从冷冻保存的MM胎儿胎粪样本中分离出该分类群的最高读取计数。微球菌科分离物不能用传统的选择性培养基回收，只能在模拟胎儿肠道环境的培养条件下获得（补充表5），包括添加胎盘类固醇激素或THP1人类单核细胞，提示它们可能代表子宫内的微生物选择压力。用这些培养方法或传统的选择培养基不能从MM样品中培养乳酸杆菌。利用全长16sr RNA序列和SILVA数据库（补充表5），将从单细胞共培养物中分离出的胎儿细菌分类为微球菌。在单核细胞存在的情况下也分离出其他物种（补充表5）。与OTU10的16sr RNA V4区域同源性最高的胎儿分离物（97%）被用于进一步研究（Micro36，图3a，扩展数据5和补充表5）。
我们假设，在模拟子宫肠道环境的培养条件下，胎儿Micrococcus luteus（藤黄微球菌）比亲缘系统发育的微球菌表现出更大的适应优势。因此，我们在孕酮和/或β-雌二醇的妊娠晚期脐血浓度达到峰值时，检测了其生长情况以及两个参考菌株MicroRef1（美国型培养物收集（ATCC）4698）和MicroRef2（ATCC 12698）的生长情况。Micro36在碳限制培养基中表现出独特的孕酮和β-雌二醇生长能力，尽管细胞密度较低（图3b和扩展数据6a，b）。在富含碳的条件下，与之前报道的类固醇激素的抑菌作用一致，孕酮和β-雌二醇（但不是单独的β-雌二醇）普遍抑制了所有三株藤黄微球菌的生长（图3b和扩展数据6c-f）。这些数据表明，低营养基质利用率和妊娠激素的条件允许特定胎儿细菌菌株的有限生长，为人类妊娠期间肠道细菌负荷的控制提供了解释。
单核细胞在分离初始微球菌中的必要性（补充表5）表明其在吞噬细胞内生存的能力。将分离的人胎肠原代HLA-DR+抗原呈递细胞（APCs）清除胞内细菌，并与分离的胎儿微球菌孵育，进行吞噬试验和庆大霉素保护试验。在24小时时， 1×107菌落形成单位（c.f.u.）ml-1的Micro 36被重新记录，并且胎儿分离物在48小时时在1×106c.f.u.ml-1的APCs中保持存活（图3c），表明细胞内存活时间延长。对照参考菌株MicroRef1和MicroRef2在可比条件下（图3c）在较小程度上不可行。使用带有额外大肠杆菌对照（扩展数据6g）的RAW264.7巨噬细胞系获得类似结果，并且在这两个实验的时间过程中（扩展数据6h，i）未产生庆大霉素抗性。这种胎儿微球菌菌株在吞噬细胞内的存活能力提供了保护进入胎儿肠道的潜在机制。
Micro36的全基因组测序（补充表6）允许对分离物进行高分辨率分类，并在与系统发生学亲属比较时确定了共享和独特的基因组特征。Micro36的全基因组平均核苷酸同源性（ANI）为96.9%，由全基因组ANI与其他人类菌种进行聚类，但不包括环境中的M.luteus分离株（图3d和补充表7）。对我们的胎儿微球菌和所有可用微球菌基因组进行全基因组分析，确定了用于构建高分辨率系统发育的共享单拷贝基因（扩展数据7）（相关分支的bootstrap值为1，图3e）。使用96.5%的ANI物种形成切断，Micro36被归类为一株M.luteus。
与M.luteus（MicroRef1）相比，Micro36显示了425个独特的基因，其中256个被注释（补充表8）。Micro36的基因组特征包括两个固醇载体蛋白和一个假定的甾体酮异构酶，这通常有助于甾体激素的去乙酰化。基因组还编码儿茶酚途径中的活性氧和氮自由基还原酶和基因。虽然这些基因的广泛流行尚待确定，但这些数据提供了可能的机制，Micro36可以在胎盘激素上生长（图3b），在吞噬细胞中保持存活（图3c），在缺氧条件下与MM相关上皮中NOS2升高相关（图2f）。
图3. 从胎儿胎粪中分离的微球菌对胎儿环境有适应性
为了确定是否在产后婴儿样本中发现了M.luteus分离物，我们利用了来自三个独立的早期生活同居者的公共可用16S rRNA数据。序列显示与我们的胎儿分离物在整个早期（12个月以内；补充表9）中检测到≥97%的同源性；但是，同源性最高的序列（≥99%，补充表9）主要出现在婴儿胎粪（第一次大便）样本中（扩展数据8a）。M.luteus在婴儿样本中含量较低，但在两个独立的代谢组26,27（扩展数据8b，c）中在产后胎粪中含量最高。这些物种在分娩时在母体胸部和阴道口中被检测到，并且在母体大便中含量不高（扩展数据8b，c）。在我们的胎儿胎粪样本中，当考虑所有样本时，每个样本中检测到的OTU数量和微球菌科OTU10的相对丰度均与胎龄无关（扩展数据8d，e）。然而，在MM组中，OTU10相对丰度与胎龄之间存在明显的正相关（Pearson's r=0.5，P=0.1；扩展数据4f）。这表明肠道Micro36或高度相关的菌株可能在妊娠期间增加，至少持续到出生，并可能在出生后通过系统发育相关的物种获得成功。
MM与胎儿上皮基因表达的不同程序相关（图2）。因此，我们通过分析体外暴露于Micro36 4h的原代人胎儿肠上皮细胞（n=2）的转录组，检测了胎儿M.luteus诱导特征性特征的能力。当Micro36暴露的上皮细胞与培养基对照组比较时，观察到转录差异（图4a）。正如预期的那样，短期暴露于体外浮游细菌培养物并不能完全重现在MM-E中观察到的胎儿肠道转录体模式（图4a）。尽管如此，微生物暴露诱导TLR6的表达，其下游调节因子NKFB在MM-E中富集（图4a，b）。这些数据表明，即使在短期的胎儿细菌暴露后，胎儿小肠上皮细胞对微球菌也表现出跨膜反应，部分地再现了在MM-E中观察到的特征。
免疫细胞募集和调节介质在MM-E中的高表达（图2f）导致我们评估Micro36影响从脾脏获得的主要胎儿HLA-DR+ APC功能的能力（补充图3）。在不降低细胞活力的情况下（扩展数据9a），Micro36和两个参考菌株诱导胎儿产生与肠巨噬细胞（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和G-CSF）以及白细胞介素（IL）-10（图4c-e）成熟相关的细胞因子，促进免疫耐受性环境。与参考菌株相比，Micro36诱导的肿瘤坏死因子（TNF）-α水平较低，表明其限制APC炎症的能力（图4f）。LLT1是胎儿特异性抑制性C型凝集素CD161的天然配体，在胎儿肠道巨噬细胞上表达，可在APCs的TLR激活时诱导表达。考虑到胎儿M.luteus在体外诱导胎儿上皮细胞TLR6的能力，我们检测了它是否能诱导人胎脾原发性APCs上的LLT1表达。与系统发育相关的菌株相比，只有胎儿Micro36诱导了LLT1的表达，并且与感染的多样性成比例，尽管低于LP-APCs体外观察到的水平（图4g-i）。
图4. 胎儿微球菌分离物在体外促进免疫耐受表型
由于结扎（ligation）CD161抑制胎儿肠道PLZF+CD161+ T细胞产生IFN-γ，我们推测Micro36可能特异性地调节这些T细胞的炎性潜能。经Micro36或MicroRef1预处理的分类脾APC（扩展数据9b）与自体、胎儿肠效应记忆T细胞（纯度>99%）共孵育，其中大部分表达PLZF和CD161（扩展数据9c，d）。与3d后的MicroRef1相比，Micro36暴露导致这些T细胞产生IFN-γ的显著减少（图4j），表明胎儿M.luteus诱导了免疫耐受。在影响PLZF+ T细胞功能的同时，Micro36对这些细胞或调节性T细胞的比例积累没有影响（扩展数据9e，f）且在APC T细胞共培养5d后不影响IL-17A、IL-17F、GM-CSF、IL-4、IL-10、IL-13或TNF-α的产生（扩展数据9g-m）。总之，这些数据表明，胎儿肠道免疫细胞能够对细菌产生炎症反应，而胎儿M.luteus可能通过诱导耐受性APCs和抑制胎儿记忆T细胞产生IFN-γ来绕过这一点。
讨论
子宫内是否存在细菌是有争议的，因为通常用于低负荷环境中细菌鉴定的分子方法固有的局限性。当细菌负荷极低时，背景噪声和假阳性在技术阴性对照中很常见，因此，简单地去除这些对照中检测到的所有分类群并不合适。在我们的研究中，尽管改进了现有的促进细菌信号的分子方法，但16S rRNA测序数据仍然存在噪声，并且在大多数样本（70%）中识别出了一个与程序性或胎儿肾脏控制不明显的稀疏细菌信号。使用一种分类单元过滤方法，集中于在大多数阴性对照中检测到的信号，导致将一个微球菌分类单元识别为在胎粪样本中富集的少量盘状无生命分类单元之一。利用这些分子数据作为胎儿细菌物种分离的指南，我们随后从平行保存的样品中培养藤黄微球菌，这些样品在样品处理过程中从未遇到过提取缓冲液。分子细菌信号比显微镜下鉴定的信号要稀疏得多，这表明我们去除污染分类群可能抑制了更广泛的细菌信号，并支持以前关于缓冲液控制中污染分类群假阳性分类的报道。我们的分子数据在50份胎儿肠道样本中仅发现17个不可归因于污染的额外分类群，这表明胎儿肠道中的条件高度限制了细菌，其机制值得进一步研究。
虽然在低负荷细菌环境中处理污染的最佳方法存在争议，但我们的数据表明，目前的分子方法本身不足以支持或拒绝子宫内不育假说。通过结合分子细菌检测、免疫相关、显微镜观察、菌株分离和离体实验，我们的研究为妊娠中期人类胎儿肠道中存在稀疏但有活力的细菌提供了直接和间接的证据，并能通过胎儿免疫限制炎症潜能细胞群。有可能是本研究中未调查的污染源产生的细菌信号，但据我们判断，确凿的证据表明，限制细菌进入人类胎儿肠道并不是绝对的。我们注意到，由于缺乏与我们队列中的样本相关的临床数据（根据我们的制度协议确定的男性年龄），限制了我们检查与微球菌鉴定相关的妊娠特征的能力，这是后续研究的一个重要考虑因素。
胎儿微球菌最有可能来自母体宫颈阴道微生物群，通常是这个属。虽然我们的胎儿微球菌分离物显示出与迷走神经微球菌分离物相似的基因组，但它也编码了在这些菌株中未发现的菌株特异性基因，这可能在胎儿肠道的强选择性条件下提供生存优势。事实上，胎儿M.luteus编码一种可能参与类固醇代谢的酮异构酶，在低营养条件下，在孕酮和β-雌二醇存在下表现出独特的生长受限能力。这一观察结果加上M.luteus在饥饿条件下可以以休眠、存活但不可培养的状态存在，可能允许它在营养有限和胎儿肠道中暴露妊娠激素的条件下持续存在。与这一假设一致，肠上皮转录组分析显示，在发现滕黄微球菌的胎儿样本中，微生物营养基质（包括粘蛋白糖蛋白MUC3A）的表达较低。总的来说，这些观察结果为检测胎儿肠道样本中的滕黄微球菌特异性亚群提供了一个潜在的解释，在这些亚群中，营养限制和妊娠激素的普遍条件可能导致M.luteus的有限存在。
细菌的存在可能在中晚期并不普遍，但在我们的研究中，微球菌与肠上皮和LP记忆T细胞室的免疫状态有关。胎儿肠道中的微球菌调节黏膜免疫，免疫系统反过来影响宿主所能耐受的微生物。因此，似乎可以为特定的M.luteus种属另外选择上皮免疫和LP免疫。反过来，微球菌限制了这些细胞的致炎能力，这可能会培养一个允许其在子宫内存活的耐受环境。然而，我们认识到其他发育因素，如干细胞生态位、胎儿T细胞发育为调节性T细胞的倾向和吞食羊水的抗原，也影响产前免疫。
最近对胎儿免疫的研究提出了一种假设，即子宫内的细菌信号会引发一种适应性免疫反应，包括T细胞活化。胎儿T细胞对非感染的母体和自身抗原有反应，并能在肠内形成记忆。胎儿肠道中存在的细菌表明，细菌抗原也可能有助于T细胞的活化，因为胎儿肠道T细胞并不完全表现出耐受性表型。它们在没有全身炎症的情况下产生炎性细胞因子的能力表明子宫内免疫反应的肠道比较，这可能对胎儿肠道细菌的耐受或清除至关重要。胎儿肠道微球菌增多与产生IFN-γ的粘膜记忆PLZF+CD161+ T细胞比例增加有关，只有胎儿微球菌分离出这些T细胞减少IFN-γ的产生。虽然胎儿微球菌可能引起许多反应，但在APCs上特异性地诱导LLT1识别了一种潜在的免疫调节机制，这是胎儿适应性免疫所独有的。因此，对胎儿微球菌的免疫记忆始于子宫。
胎儿肠道如何限制细菌的存在尚不清楚，尽管在妊娠激素存在和吞噬细胞内，特定细菌在营养限制条件下的生存能力为子宫内的生存提供了可能的机制。子宫内细菌相互作用或缺乏这种相互作用对长期健康的影响仍有待确定。
评论
肠道菌群在免疫发育过程中有重要作用。在妊娠早期，胎儿的肠粘膜免疫就已经开始发育，然而目前尚不清楚子宫内是否存在活菌与胎儿的肠道免疫系统互作。Nature Medicine发表的这一项最新研究，用扫描电子显微镜和16S rRNA测序表明，孕中期的人类胎儿肠道内存在很有限的细菌，并分离出其中的一种优势细菌（Micrococcus luteus，藤黄微球菌）。该菌表现出对子宫内胎儿肠道环境的适应性，并在体外呈现免疫调节活性，可能对胎儿肠道免疫发育有潜在调控作用。这些发现拓展了人们对生命早期肠道菌群定殖、菌群对免疫发育的影响的认知，值得进一步验证和研究。
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