北京博奧龍：多克隆抗體制備實驗步驟有哪些？

抗原刺激機體，產生免疫學反應，由機體的漿細胞合成並分泌的與抗原有特異性結合能力的一組免疫球蛋白，這種與抗原有特異性結合能力的免疫球蛋白就是抗體。一般而言，抗體按靶位點不同主要分為單克隆抗體和多克隆抗體 ，由多個B淋巴細胞克隆產生的，受到多種抗原決定簇刺激並可以與多種抗原表位結合的抗體就是多克隆抗體 ， 本篇主要講述兔源性多克隆抗體制備的相關流程。

抗原有兩個基本特性，即抗原性和免疫原性。有抗原性的物質不一定有免疫原性，所以由此引出半抗原和完全全抗原，半抗原必須經過經過一定的改造（偶聯蛋白載體BSA，OVA或者HSA等大分子物質）方能成為完全。一般而言完全抗原分子量越大（大於10KDa），結構越複雜引起免疫反應的能力也就越強。

抗體就是能與特異性抗原結合的免疫球蛋白，抗體一般分為多克隆抗體和單克隆抗體，多克隆抗體能與抗原的多個表位結合。本篇主要講述兔來源的多克隆抗體的生產步驟

多抗一般製備流程：完全抗原的準備→兔子的免疫→ 效價檢測和終放→抗體親和純化→抗體的濃縮和保存。

具體實驗步驟如下：

1.兔子的準備

挑選健康的6周大小的新西蘭大白兔兩隻（約2Kg），使其適應新的生活環境，至少穩定幾天再進行首次取血.

預採血（作陰性參照用）

1.1 將兔子小心的放入固定的架中,使兔子平靜；

1.2小心剃去兔耳上的毛以使血管清晰可見(也可不剃)；

1.3如果有必要,可用小棉球沾酒精塗抹血管部位,使血管膨脹；

1.4用注射器從耳靜脈抽取約10ml血液(約5ml血清)；

1.5小心抽出針頭,適當按壓傷口以免流血,然後用酒精棉球消毒傷口；

1.6將收集的血液置於37`C滅活30min,最後置於4`C過夜使其凝結釋放血清；

1.7將凝結好的血液在10000r／min離心10min； h.收集上清，即為血清。

2. 兔子的免疫

2.1 注射兩隻兔子的抗原為1ml,抗原緩衝溶液必須不含對兔子有害的化學試劑.每隻兔子初次免疫400ug抗原比較適合,也可適當減少以獲得更好的結果，後續免疫每次為100ug即可。

2.2 將1ml的佛氏完全佐劑與準備好的1ml抗原充分混勻,呈乳白色；

2.3 小心從籠中取出兔子，每隻兔子免疫4個部位(背部和大腿根部均可),每個部位250ul,針頭呈45度角插入皮下1-2cm,注射完後停留數秒以防止抗原外流。

2.4 免疫週期為20天,免疫完後7-10天取血(包括中途測試取血和最終放血),總共免疫4-5次。

3.效價檢測

3.1 2個參照:陰性參照為預取血血清，均以1抗起始濃度稀釋(封閉稀釋液);陽性參照為以前陽性血清

3.2 於96孔板中每孔滴加100ul，1ug/ml抗原，於4℃過夜，也可以37℃孵育2小時。

3.3倒掉抗原溶液，每孔加入200ul的封閉液，4℃過夜或者37℃孵育2小時。

3.4倒去封閉液，在吸水紙上拍打儘量吸乾殘留液體,用洗滌液洗板三次,每次儘量拍幹殘留液體,若要放置一段時間, 37℃烘乾並用封口袋封好於-20℃存放。

3.5取包被好的96孔板，第一孔加入陰性參照液100ul，第二孔加入陽性參照液100ul，第三孔加入1:500的待測抗血清，後續各孔在此基礎上倍比稀釋，於37℃孵育1 小時。

3.6倒掉液體，用洗滌液洗板三次，拍幹。每孔加入100ul的HRP標記的小鼠抗兔IgG（1：2000稀釋），於37℃孵育45分鐘。

3.7倒掉液體，用洗滌液洗板三次，拍幹。每孔加入100ul的TMB底物（Sigma 單組份TMB ）37℃孵育5—20分鐘(根據顏色深淺來決定顯色的時間)。

3.8每孔加入50ul的終止液（2N H2SO4），在酶標儀上讀取波長450nm處的吸光值。

抗體效價檢測達到100萬以上後可以對兔子進行終放血。抗體的純化

4.抗體的親和---親和柱的製備

4.1 稱取1mg CNBr-Sepherose 4B的瓊脂糖凝膠加入2mmol／L的鹽酸中，4`C過夜使其充分溶漲，可獲得3ml溶漲膠。

4.2 將凝膠轉移入純化柱中，用約20ml 2mmol／L的鹽酸洗介質3次。

4.3 用偶聯緩衝液洗介質一次，因為活化基團在偶聯緩衝液PH值下易水解，所以此步驟最好在幾分鐘內完成。

4.4 將溶解在5ml偶聯緩衝液中的5-10mg的抗原加入凝膠中

4.5 室溫下輕輕混合搖動2-4小時，或4`C過夜，如需測定結合效率此步驟結束後取少量溶液待測。用20ml的偶聯緩衝液洗介質一次。

4.6 加入15m l 1% BSA 溶液室溫下孵育2小時或4`C過夜。

4.7 用磷酸鹽緩衝液洗滌介質3次以上，每次15ml以上 h.

4.8抗原固相化完成，可用於純化。

4.9 若不立即使用或者使用後，用20%的乙醇封存。

5.抗血清的純化和保存

5.1抗血清用PBS等體積稀釋，5000-10000r／min離心15分鐘，取上清.

5.2用10倍體積的PBS清洗抗原親和柱以平衡柱子。

5.3將稀釋好的抗血清10ml加入平衡好的柱子中。

5.4室溫下輕輕混合搖動2-4小時，或4`C過夜

5.5用10倍體積的PBS清洗抗原柱，以洗去結合在柱子上的雜蛋白

5.6用2倍體積的抗體洗脫液洗滌柱子，以得到特異性抗體

5.7用10倍體積PBS平衡柱子

5.8用20%的酒精封存柱子，4`C保存。

在得到洗脫的抗體後，經蔗糖或聚乙二醇濃縮後於PBS中透析除鹽，使用紫外可見分光光度計在波長280nm處測定抗體OD值，所得OD值除以1.35即為所測抗體的濃度，添加40-50%甘油置於-20`C可長期保存。

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