原创 Jione、song 微生态 2019-11-03
导读
随着人们生活水平的提高，肥胖已成为大流行病。众所周知，久坐的生活方式，尤其是高能量饮食是重要的促肥胖因素。有研究显示，肠道菌群在新陈代谢中起重要作用，而不同的饮食会塑造不同的肠道菌群。高脂饮食（HFD）摄入过多的能量被认为是代谢综合征的原因，饮食中的脂肪而非能量也是HFD诱发的实验性肥胖的关键因素。相关研究已经表明，饮食中的脂肪可以通过各种分子途径调节与脂质代谢和与食欲有关的激素信号传导相关的基因，但不同的饮食导致相似的糖尿病状态尚不清楚。研究人员为了解微生物群与早期代谢综合症之间的关联，给小鼠喂食两种能量相同脂糖比不同的高能饮食（HED），使用DNA分离试剂盒提取粪便样本中的总基因组DNA，参照16S宏基因组测序文库的样品制备方案制备测序样品，随后进行测序分析，通过RDP分类器方法与Greengenes数据库比较进行注释。另外，提取的DNA超声破碎至100-800bp用于宏基因组的二代测序和生物信息学分析。将细菌、细胞和秀丽隐杆线虫分别培养，进行微生物和代谢产物的功能分析。结果表明两种饮食导致不同的微生物群，但糖尿病状态相似。微生物基因谱没有显着差异，并且鉴定了许多常见的代谢产物，包括L-天冬氨酸、胆甾醇-3-醇（5，3）和菜油甾醇，它们与脂肪生成和炎症有关。本研究显示不同的代谢综合征诱导饮食可能导致不同的微生物群，但具有相似的微生物群和代谢组，同时表明宏基因组和代谢组对于肥胖和代谢综合症的预后和发病机理至关重要。
论文ID
原名：Distinct Gut Microbiota Induced by Different Fat-to-Sugar Ratio High-Energy Diets Share Similar Pro-obesity Genetic and Metabolite Profiles in Prediabetic Mice
译名：不同脂糖比的高能量饮食诱导的肠道菌群在糖尿病前期小鼠中具有相似的促肥胖基因和代谢产物
期刊：mSystems
IF：6.519
发表时间：2019.10
通讯作者单位：江南大学无锡医学院＆食品科学与技术学院
DOI: 10.1128/mSystems.00219-19
实验设计
本研究给5周龄雄性小鼠以NC（对照食物）饮食、高脂（HF）饮食和高蔗糖（HS）饮食120天，并预先测量禁食10小时后的基础葡萄糖水平。随后，提取粪便样本中的总基因组DNA，参照16S宏基因组测序文库的样品制备方案制备测序样品，随后进行测序分析，通过RDP分类器方法与Greengenes数据库比较进行注释。另外，提取的DNA超声破碎至100-800bp用于宏基因组的下代测序和生物信息学分析。将大肠杆菌菌株OP50、植物乳杆菌ZS2058乳酸菌BB-12和长双歧杆菌亚种进行培养，通过显微镜计数，同时培养秀丽隐杆线虫，将大肠杆菌OP50加入培养基作为食物，共培养一段时间后，转移蠕虫，将大肠杆菌OP50和代谢物添加至S培养基中培养，此时线虫已经转移到胞内。经过48h培养后，进行油红O染色，进行观察。随后将OP9胚胎干细胞和RAW264.7巨噬细胞复苏培养，维持生长状态。将粪便样品在甲醇-水（5/1）中匀化，淬灭并超声处理以释放代谢物，进行甲硅烷基化衍生化以用于气相色谱-质谱分析。利用RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA进行荧光定量分析。收集细胞的上清，离心后进行ELISA检测其中的细胞因子。实验结果用SPSS进行统计分析。
结果
1 HF饮食和HS饮食均会诱发小鼠前驱糖尿病
常规高能量饮食（HED）喂养120天后，小鼠表现出超重和血糖异常（图1A至C）。在第40天，饲喂HF但不饲喂HS的小鼠显示超重（图1D），空腹血糖改变和葡萄糖耐量降低（图1E和F）。这些结果表明，HF和HS饮食可能在不同的时程中诱发代谢紊乱。
图1 HF饮食和HS饮食均诱导小鼠发生糖尿病前期
2 在糖尿病前期小鼠中，不同的脂/糖比会形成不同的肠道菌群。
饲喂HF和HS饮食的小鼠在门和目水平上有明显的变化（图2A）。在HF和HS组中，Chao1指数显着增加，表明菌群丰富度上调（图2B）。Shannon和Simpson指数表明，饲喂正常对照食物（NC）和HED的小鼠的肠道菌群多样性没有显着差异（图2B），但样品根据其饮食却明显聚集（图2C）。加权UniFrac树分析倾向聚类，表明对照饮食聚类远离两个HED聚类（图2D）。结果显示，不同糖脂比的饮食在糖尿病前期小鼠中形成了独特的肠道菌群。
为了进一步研究微生物群的变化，线性判别分析效果量（LEfSe）工具被用于表征饲喂NC、HF和HS日粮的小鼠中肠道菌群的差异（图2E和F）。通常，有四个明显不同的门，对照组中的拟杆菌属较高，HF和HS组中的放线菌和厚壁菌门分别丰富，而对照组中未检测到疣状微生物（图2E至G）。根据LEfSe分析，将这些丰富的分类单元视为潜在的生物标记物（图2E）。
拟杆菌科是NC组的潜在生物标志物。双歧杆菌科和乳杆菌科是HF组的代表，疣微菌科是HS组的标志（图2E和F）。HS组分别在属和家族水平上增加（图2G）。主成分分析（PCA）显示，微生物群也根据饮食而聚集（图2H）。另外，属水平的变化不代表该属所有物种的变化（参见图S1）。结果表明，HF和HS饮食在糖尿病前期小鼠中诱发了两种与肥胖相关的肠道菌群的不同模式。
图2 不同的脂糖比在糖尿病前期小鼠体内形成不同的肠道菌群
3 HF和HS饮食丰富了相似的基因谱
宏基因组测序显示总共检测到3821个基因。PCA表明，HF和HS组的基因谱很接近，但与对照组的基因谱有很大差异，尽管这两组之间的细菌种类明显不同 （图2H和图3A）。热图分析显示500个最丰富的基因的表达，相似性（ANOSIM）统计量R（Bray-Curtis距离）的分析表明，HF和HS组的基因谱具有较多相似性（图3B）。HF和HS组中20个表达最高的基因中有16个重叠，它们是K03427（hsdM），K17320（lplC），K17319（lplB），K03205（virD4），K01190（lacZ），K03043（rpoB），K02438（glgX），K03569（mreB），K00640（cysE），K03498（trkH），trkG和ktrB），K02033（ABC.PE.P），K03046（rpoC），K02470（gyrB），K02970（RP-S21，MRPS21和rpsU），K04043（dnaK和HSPA9）和K01156（res）（图3C）。此外，将富集在HF组中的224个基因与富集于HS组中的213个基因进行比较，发现112个基因是相同的（图3D和图S2至S4）。HF和HS组中20个最丰富的基因也重叠（图3E）。然后将这些基因与KEGG进行比对，发现富集在HF组中的大多数基因都可以在乳杆菌或双歧杆菌中找到，而富集在HS组中的大多数基因都来自阿克曼虫病（图3E），并且四个基因（K00768，K02114，K03413和K06898）都在HF和HS（图3E）两个组中基因。排名前50位的富集基因，在HF和HS组中都发现了25个基因，其中17个基因可以定位于乳杆菌，双歧杆菌和阿克曼菌病（图3F）。
根据错误发现率（FDR）（25％）或P值（5％），缩小到具有最高归一化富集得分（NES）或显着集的20个基因集，相似性更大（图3G）。常见途径主要为参与脂质和氨基酸的能量代谢和生物合成（图3H和图S5）。结果表明，尽管塑造了不同的微生物群，但HF和HS饮食丰富了相似的基因谱。
HF组和HS组的比较发现一些显着不同的基因集，在图3H中显示为红色条（富含HF组）或蓝色条（富含HS组）。HFD优先富集参与能量代谢和氨基酸代谢的基因，而HSD倾向于增加核苷酸代谢相关基因（图3H和图S6）。
图3 HF和HS饮食丰富了相似的基因谱。
4 HF和HS诱导相似的代谢产物谱
在HED喂养的小鼠中，硬脂酸的比例增加，而D-（+）-吡喃木糖（D-木糖），胆甾烷和胆固醇降低（图4A）。当用十六烷酸（猪油中的主要成分之一）归一化时，9,12-十八碳二烯酸和硬脂酸的增加以及胆甾醇-3-醇（5，3）的显着减少 。此外，HF和HS组小鼠粪便中的L-天冬氨酸，胆甾醇7-烯-3-醇和菜油甾醇发生变化，但两组间差异均无统计学意义（图4A）。
KO02030（细菌趋化性），KO00770（泛酸和辅酶A [CoA]生物合成），KO01230（氨基酸的生物合成），KO00340（组氨酸代谢），KO01200（碳代谢），KO00300（赖氨酸生物合成）和KO02020（两个的富集组分系统）与L-天冬氨酸的增加一致。KO00061（脂肪酸生物合成），KO00561（甘油脂质代谢）和KO00564（甘油磷脂代谢）的富集可能对应于9,12-十八碳二烯酸和硬脂酸的增加（图3H，图4B，图S5和图5H）。
在HED组中被还原的1-酰基-甘油-3-磷酸酰基转移酶（K00655）和磷脂酰胞苷转移酶（K00981）有助于各种脂肪酸和相关脂质的变化（图3H和图4B和C）。L-天冬酰胺酶（K01424），天冬酰胺合成酶（K01953）和天冬氨酸转氨酶（K00812）的变化导致L-天冬氨酸增加（图3H和图4B和C）。木糖异构酶（K01805）的下调将D-木吡喃糖转化为D-木酮糖，可能导致D-木吡喃糖的减少（图3H以及图4B和C）。此外，L-天冬氨酸可以是各种次级代谢途径（KO01230，KO00240，KO02030，KO00300，KO00770和KO01200）的底物，这些途径也被富集（图3H和图S5和S6）。
图4 HF和HS模拟相似的代谢物分布
5 HED调节的微生物和代谢产物影响脂质蓄积
在HED组中，植物乳杆菌在HF、HS和对照日粮中含量低且不变，长双歧杆菌在三种日粮中含量高而不变；HED组中动物双歧杆菌减少，而丁酸梭菌有所增加（图5A）。与大肠杆菌OP50相比，植物乳杆菌ZS2058和动物双歧杆菌BB-12的摄食量减少，而长双歧杆菌JCM7053和丁酸梭状芽孢杆菌MIYAIRI 588增强了秀丽隐杆线虫的脂质蓄积（图5A）。另外，HED喂养的小鼠中的大肠杆菌也明显减少。
在NC和HED组之间，L-天冬氨酸，胆甾烷-3-醇（5、3），菜油甾醇和-生育酚的水平发生了显着变化，但胆固醇含量相对稳定（图4A）。与胆固醇相比，类固醇胆甾醇-3-醇（5、3）和菜油甾醇处理可显着减少脂质积聚，而生育酚则无作用（图5B）。罗格列酮诱导的脂肪形成受到L-天冬氨酸，胆甾醇3-ol（5，3）和菜油甾醇处理的抑制（图5C）。胆甾烷-3-ol（5，3）可以降低Cebp的表达（图5D）。
结果表明，L-天冬氨酸、胆甾醇-3-醇（5，3）和菜油甾醇可能通过不同的机制抑制脂肪生成。
图5调脂微生物和代谢产物影响脂质积累
6 HED调节的肠道代谢产物影响RAW 264.7巨噬细胞的活化
L-天冬氨酸可增加炎症性白介素1（IL-1），IL-6和肿瘤坏死因子α（TNF-）的mRNA转录，但不增加其蛋白成熟。胆甾烷在mRNA和蛋白质水平上均限制了IL-6的产生。菜油甾醇显着降低IL-6和TNF-转录以及IL-1和IL-6的产生（图6）。这些数据表明胆甾醇-3-醇（5、3）和菜油甾醇的潜在抗炎作用以及L-天冬氨酸的可能的促炎作用。
图6 HED调节的肠道代谢产物影响原始264.7巨噬细胞活化
评论
2型糖尿病（T2D）的发生对于患有前驱糖尿病的人来说是不可避免的，其3至5年的发病率约为25％。糖尿病前期可被视为可治愈的疾病状态和T2D的检查要点。因此，弄清与糖尿病前期有关的病理生理变化很重要。糖尿病饮食诱发的糖尿病肠道菌群提供了糖尿病的机制。在本研究中，两种不同的糖尿病饮食（HF和HS饮食）确实诱导了不同的肠道菌群，但具有相似的基因谱。HF饮食富含乳酸杆菌和双歧杆菌，HS饮食富含阿克曼西亚。据报道，乳酸杆菌和双歧杆菌同时使用脂肪和糖作为营养物质。生理特征上的这种差异可能是其差异富集的原因。HF和HS诱导的微生物群之间相似的基因谱可以归因于脂肪和糖都是能量物质这一事实。在分解成诸如乙酰辅酶A、NADH、FADH2和ATP之类的能量货币后，脂肪或糖将在相似基因集的调控下共享相似的下游能量利用和合成代谢过程。
在糖尿病前期小鼠中，乳杆菌、双歧杆菌和阿克曼虫明显增加。这些发现与先前的一些研究相反，这些研究表明它们减少了肥胖症患者并具有抗肥胖作用。但是，糖尿病前状态的肠道菌群可能与糖尿病患者的肠道菌群不同，乳酸菌、双歧杆菌和阿克曼菌的升高代表宿主对饮食变化的早期反应。另外，值得注意的是，这些变化是在属上而不是物种水平上，并且物种的变化通常与整个属上的不同。因此，对特定肠道环境的物种特异性适应更准确地描述了肠道菌群的功能变化。在本研究中，尽管双歧杆菌在HED组中富集，但长双歧杆菌不变，而HED组中的动物双歧杆菌减少（图5A）。在功能上，动物双歧杆菌菌株减少了秀丽隐杆线虫中的脂质积累，而长双歧杆菌则增强了该过程（图5A）。因此，动物双歧杆菌的减少可能是双歧杆菌增加的更可靠的前驱生物标志物。此外，在代谢综合症的治疗中，补充动物双歧杆菌比抑制双歧杆菌的整个属更有益。
肠道微生物相关代谢产物是微生物菌群调控宿主代谢的关键介质。通过研究弱极性代谢物，发现在HED和NC饮食衍生的代谢物之间存在一系列差异，尤其是两种固醇：菜油甾醇和胆固醇3-醇（5，3）（图4A）。菜油甾醇，一种植物来源的固醇，也是微生物的底物。据报道其与代谢综合征呈负相关。胆固醇和粪便中存在胆固醇胆固醇的代谢产物胆固醇。它们的减少还与代谢综合征有关。
在本研究中，证实了菜油甾醇和胆甾烷-3-ol（5，3）对体内和体外（OP9细胞）脂质蓄积的抑制作用。同时，这些代谢物还可以限制巨噬细胞的炎症（图6）。需要进一步研究樟脑甾醇和胆固醇3-胆甾醇（5，3）抑制代谢综合征的机理。结论
肠道菌群在宿主代谢中至关重要，尤其是在糖尿病中。然而，尽管与不同的微生物群相关联，为什么不同的饮食导致相似的糖尿病状态尚不清楚。给小鼠喂食两种能量密度相同但脂糖比不同的高能饮食（HED），以确定微生物群与早期代谢综合症之间的关联。两种饮食导致不同的微生物群，但糖尿病状态相似。结果显示，微生物基因谱没有显着差异，并且鉴定了许多常见的代谢产物，包括L-天冬氨酸、胆甾醇-3-醇（5，3）和菜油甾醇，它们与脂肪生成和炎症有关。研究表明，不同的代谢综合征诱导饮食可能导致不同的微生物群，但具有相似的微生物组和代谢组。 这表明宏基因组和代谢组对于肥胖和代谢综合症的预后和发病机理至关重要。
评论
高能量饮食是重要的促肥胖因素，而且肥胖已成为大流行病。基于先前的研究，肠道菌群在新陈代谢中起重要作用，而不同的饮食会塑造不同的肠道菌群。研究人员提出了全球范围内食物和烹饪方法为何会导致相同的肥胖症表型，基于这个问题，以及先前的研究基础，本文研究了发病机制关键阶段的菌群功能变化，探究了微生物群在这中间的重要作用，结果显示，不同的代谢综合征诱导饮食可能导致不同的微生物群。表明宏基因组和代谢组对于肥胖和代谢综合症的预后和发病机理至关重要。
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