新冠COVID-19: 病毒学、免疫学和病理学（下）健康頭條網

作者/Clifford Lowell教授

4月2号，加州大学旧金山分院（UCSF）实验室医学系主任Clifford Lowell教授在ImmunoX Initiative 俱乐部活动做了一个讲座，从病毒学、免疫学和人病理学方面对新冠做了个全面分析。

下面再来分析一下这次新冠病毒的传播路径

有个非常好的网站叫https://nextstrain.org/ncov/global ，它用种系发生学的方法将全球上传到GISAID病毒库的3365个病毒的基因序列进行分析列出病毒的演化关系，数据的时间从2019年12月直到今天，而且还在不断更新。

Figure21 新冠病毒种系关系以及传播路径

上图的左侧就是新冠病毒的种系演化图，大约有5个大的演化分枝（Clade），右侧是病毒的全球传播路径。通过用不同的颜色标注，可以清晰看出该病毒的最早起源时间、地点以及响应的传播路线。

这个图还可以用其他方式表达，如径向表达法（图22）或自由树表达法（图23）：

Figure22 新冠病毒的径向表示，中心是发源地

Figure 23 新冠病毒传播的自由树表达

这个网站的数据和可视表达完全是互动的，你可以任意选取时间点来了解当天的病毒演化情况和传播位置。图中的颜色表示国家或地区，如紫色代表中国，红色代表美国，绿色代表欧洲等。

Figure24 新冠病毒演化和传播的几个时间点

例如，如果我们选取时间点为2019年12月7号，可以看到病毒从武汉发源。把时间调到2020年1月19号，病毒已经传到加拿大、美国、澳洲和欧洲。最下面是4月24日病毒的演化树和在全球传播的情况。

通过这个可视数据库还可以看出新冠病毒对有些国家有二次传播。例如图25中1月19日传到加拿大的病毒又传入美国，又例如传到欧洲的病毒又通过伊拉克再次传入澳大利亚。

Figure25 新冠病毒的复杂传播路线

那么，我们如何来测试病毒呢？

大部分的测试是对三个病毒基因（RdRp, N和E）做标准RT-PCR反应测试。标准测试用Taqman 测试法对这三个蛋白基因做扩增。RdRp是基于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase），位于ORF1ab区，测试就是对其进行扩增看看是否能观测到，它就是药靶（drug target）。另外就是扩增测试E（包膜蛋白基因Envelope gene ）和N（核衣壳蛋白Nuclearcapsid ）。

如下图

Figure 26 阳性测试集中在三个基因序列上

这个方法是我们在中国研发的，但已经在世界各地使用，虽然引物（Primers）可能各地不太一样，但基本操作都一样，每个人都懂。现在又出现了一些新的测试方法，这是在危机压力下催生出来的新技术。例如核酸恒温扩增技术（Isothermal RPA Assay），估计今天听讲座的人90%都不知道什么是核酸恒温扩增技术。这是一种重组酶聚合酶扩增法（RPA法，recombinase polymerase amplification），可以替代PCR测试，刚刚商业化。还有个新技术叫CASPR CAS 12 和 13 核酸测试法。

什么是核酸恒温扩增技术（Isothermal RPA Assay）？它的工作方式和标准的PCR测试相同，不妥所依赖的蛋白不同。这个技术涉及的三个蛋白（主要来自噬菌体), 是重组酶（recombinase），单链结合蛋白 (single strand binding protein) 和链置换聚合酶（strand displacing polymerase）。

这种方法不需要做循环组装（Cycling），这意味着可以快速用逆转录将RNA转为DNA，在同一个试管加进内生或者外来的核酸酶来进行测试。该方法于2006年首次公布，现在有多个版本（LAMP，HAD）和引物选择键。

Figure27 核酸恒温扩增技术

在RPA测试过程中，所要测试的DNA被细胞DNA重组、修复和合成中所涉及的蛋白指数级扩增。引物与目标序列两头的引物端（Primer Ends）结合，被聚合酶引入，使得单链被单链的结合蛋白所稳定，以此获得扩增。

这一切都是在同一个温度下发生，所以你不需要做循环（Cycling），这意味着扩增的速度大大提高，即将目标序列在几分钟内进行扩增。你可以通过标准的pac-man探针来检测扩增情况（如图28）

Figure28 双标签带生物素的探针

或者用带有生物素（biotin）的探针来检测扩增子（amplicon)的存在（见图29），即用一个小的TLC测流来检测扩增子。

Figure29 TLC 侧流测试法

这个技术实在了不起，这就是Abbot刚刚推出的核酸阳性检测仪背后的技术，这个检测非常快，只需要5分钟时间。

Figure30 Abbot公司RPA核酸测试仪

另一种测试方法是所谓CRISPR-Cas 12或13核酸检测法。

我们很多人知道基因编辑使用的CRISPR CAS９，但没人知道CAS 12是什么。这是一种裂解酶（Cleavage Enzyme），来自不同的生物核酸分子杂交。与CAS9不同，它与自己的向导RNA（Guide RNA）结合并检测自己的目标序列以及对靶位进行裂解。于此同时，它启动一个非特异的单链DNA的活动。因此突然间，酶开始降解环境中所有的单链DNA（ssDNA）。（见图31）

Figure31 CRISPR-Cas12 或Cas13核酸测试

这样你就可以设计一个测试方法，（见图33）将Cas12及其向导DNA用在任何冠状病毒的核酸序列上，直接与其进行结合，然后放入一个生物素探针中并在测流试条上观测检测结果。这很像一个妊娠测试（见图32）。如果反应足够敏感，也可以在一个玻璃试管中做。

这种测试方法很快就会出来。这也是我们UCSF实验室的Charles Chu小组做的。

Figure 32 侧流结果观测条

Figure 33 CRISPR-Cas 12或13核酸检测

下面介绍新冠抗体的血清测试：

现在出来了很多测抗体的血清测试方法，大部分都是针对S蛋白和N蛋白的受体结合域（RBD）做的，用E（包膜）细胞做的较少。这些测试方法大多是酶联免疫吸附试验（ElISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay），均是根据以往对SARS和MERS的经验进行研发的结果。目前的测试方法虽然很多，但有效性均可疑，不过技术应该会很快改进并很快进入临床应用，

在中国用此测试做的结果显示，几乎所有的人出现症状后两周都会产生抗体响应。（见图34）

Figure34 抗体测试

上图中，红色曲线是总抗体数，紫色曲线是免疫球蛋白lgM，蓝色曲线是免疫球蛋白IgG，绿色曲线是与IgM和IgG相对应的病毒核算RNA。我不明白在这个实验中为什么IgM和IgG比抗体总数少那么多，不过也就是一个例子。

欧洲做了一个控制的较好的血清抗体测试，刚刚发表在bioRxiv上。测试所用的血清来自存储的SARS和MERS病人。图35显示了对于新冠和SARS，抗体响应均与病情程度正相关。

Figure 35 抗体响应在新冠和SARS上的差异

Figure36 S或S1域受到SARS, MERS和新冠感染时抗体IgG的响应情况

可见，对于S域而言，抗体LgG对新冠和SARS响应均明显，但对于S1域，抗体LgG只对新冠病毒有响应。

Figure37 抗体对各种病毒的响应水平

从图37看，ELISA抗体LgG在S1域上仅仅对SARS和新冠有响应，但对其他病毒毫无响应。H冠状病毒H微阵产生的抗体对MERS和SARS病毒基本不响应，但对其他病毒却具有较强响应。

下面这个讨论很重要，很多人问：新冠感染后产生的抗体是否有保护作用？疫苗会有用吗？

要回答这个问题，还得借助我们对SARS和MERS的了解。有一点是确定的：对SARS和MERS，用小鼠和猕猴做的实验中，预防性和治疗性的针对S蛋白而制作的的单抗效果的确很好，其工作机制通常是直接阻断与S蛋白的结合。实验中会有些病毒逃逸，所以实验中常常同时使用两种单抗来防止病毒逃逸。

有趣的是，Gary Nabel 早在2005年的论文显示某些单抗蛋白实际上可以启动S蛋白并加重感染。（https://www.pnas.org/content/102/3/797 Evasion of antibody neutralization in emerging severe acute respiratory syndrome coronaviruses，Gary J. Nabel）研究发现，抗体IgA与MERS病毒有逆相关关系，可是问题是：对于MERS病毒，病人康复后的抗体水平会迅速下降，而对于SARS病毒，抗体IgG在痊愈后的6年中会持续下降。

所以并不能笼统说单抗是好或是坏，这个要具体分析。我们将看到，许多公司会很快做出这些用于消极治疗的单抗类型。不过要明白，这些治疗性的单抗并不是疫苗，也与免疫无关，这只是消极免疫。如果我们想了解人体康复后对于新冠病毒是不是已经产生了适应性免疫，我们还必须看看关联性研究的数据。

浆膜的免疫球蛋白IgA水平和MERS病人的病毒活动水平有相关性，问题是，病人康复后抗体水平会迅速下降。事实上，在SARS的流行期间，人们的免疫球蛋白水平IgG水平随时间会下降。所以真正的答案是，我们并不清楚感染后是否会得到免疫。

不过我们可以看看动物的免疫实验情况，来了解是否痊愈后会不会获得免疫，或疫苗究竟会不会起作用。在这次新冠病毒流行之前的SARS和MERS流行期间，我们就对动物做了大量研究。亚单位疫苗或灭活的疫苗在小鼠和猕猴的研究中都被证明很有效，都产生了很好的抗体响应。不过在这这些实验中，当这些动物再次受到病毒感染的威胁时，情况反而会变糟。这说明体内的疫苗阻碍了这些动物身体的免疫响应，其结果是这些动物变得更容易被感染。这是你完全想不到的。我们现在的理解是，这就是所谓ADE效应（Antibody Dependent Enhancement)，即抗体的依赖性增强效应。对登革热疫苗而言，这种ADE现象已经被研究的很详细了。注射过某种类型登革热疫苗的病人如果被另一种登革热病毒感染，情况就会变得更糟。

究竟什么是抗体依赖性增强（ADE）效应呢？

人体首次感染某种病毒时，会产生高浓度的抗体并将病毒清除。可是人体康复后再次被相关的病毒感染时，就会产生所谓抗体的交叉响应（译者注：cross-reactive antibody，指的是身体受到某种病毒攻击时，抗体在其Fab区会产生一种特异的并与该病毒抗原亲和的氨基酸序列，但是如果该抗体对另一种病毒抗原也具有亲和性的话，那么当这种病原出现时，抗体也会产生响应。这种对多种抗原产生的抗体响应就被称为交叉响应）。

对登革热而言，ADE被认为是出血性反应的原因。登革热病毒会通过其Fc受体进入细胞，并会试图进入非溶酶体囊泡（non-lysosomal subcellular compartment）。其机制如下：当病人首次被病毒感染时，体内会产生高浓度的抗体并将病毒清除，也就是说，巨噬细胞吸收了大量溶酶体成份（Lysosomal Component）。但该病人再次被类似病毒感染时，病毒浓度可能并不高，或仅仅产生少量交叉响应。可是，病毒粒子会直接被巨噬细胞中的非溶解酶囊泡所吸收，这些非溶解酶囊泡并不能杀死病毒粒子，而是会让病毒粒子逃逸到细胞质中，进入其它非溶酶体的囊泡中，这样就会加强了病毒侵入细胞的能力。（图38）

很多人担心这可能正是这次新冠病毒流行所出现的情形，即很多人体内已经有了针对其他冠状病毒的抗体，这些抗体产生的交叉响应加重了新冠病毒对人体的伤害，这就是ADE现象。我们需要对病人做血清测试，看看病人抗体浓度高是不是会更糟？很多人已经对冠状病毒有了抗体，这些抗体可能会产生交叉反应。之所以那么多人出现严重的症状，可能正是ADE所造成的。

另一个问题相关的问题是：为什么老人被感染后病情更糟？我的猜测是因为他们有较长时间接触各种其他冠状病毒，体内容易产生抗体交叉响应。我有个假说，下面会具体分析。

还有一个需要回答的问题是：能用康复病人的血浆（Recovered Plasma Therapy）进行新冠治疗吗？？？天啦，我们对此可要小心！

Figure38 ADE 示意图

再来谈谈SARS-冠状病毒疫苗的研制情况：

人类在疫苗研制方面做了很多努力。亚单位疫苗和灭活疫苗已经过时了，今后将是基于DNA的疫苗。我们会看到有些基于DNA的疫苗已经进入了临床试验阶段，这些药物试图通过改变佐药（adjuvant）来避免产生ADE效应。显然，基于DNA的疫苗，或者经过灭活的疫苗会诱导细胞免疫。通过动物实验我们知道细胞免疫对抵抗冠状病毒是很重要的，这点我们通过转基因的小鼠应对SARS病毒的实验中已经得到证实，尽管转基因模型可能会导致肺部受损。CD8+1 T细胞响应在猕猴对付MERS病毒上十分重要。

显然，这是一种DNA病毒疫苗而非经典的亚单位疫苗，或某种经过沸煮灭活的病毒所制作的疫苗。这类疫苗最终会被研制出来，但正如很多人说的那样，会花很长时间，这需要我们对病毒的病理有更多了解。

要想研制灭活的疫苗，必须要明白病毒如何抑制人体的自然免疫响应。说到底，致病一定是天生免疫响应出了问题。这些病毒和其他病毒一样，有着一个不可思议的工具库，用来关闭人体的天生免疫响应。

Figure 39 人类冠状蛋白对天生免疫系统的信号通道产生的影响

西班牙国家生物中心的Enjuanes等2016年在Adv Viral Res杂志上发表了一篇论文，题目叫：《冠状病毒的毒性和疫苗研发的分子学基础》（Molecular Basis of Coronavirus Virulence and Vaccine Development），提出病毒疫苗必须能够诱发免疫系统的响应，要足够稳定、安全和具有长期免疫能力。下图来自本篇论文，解释了人类冠状蛋白对天生免疫系统的信号通道产生的影响，或者说病毒是如何关闭了人的天生免疫机制。

冠状病毒有某种搞乱人体天生免疫响应的基因，会阻碍抗体对病毒的响应并加快病毒复制。病毒的非结构蛋白（Nsp，non-structural protein) I-型会阻断干扰素（interferon, IFN）响应，从而抑制了蛋白翻译。Nsp3 有ADR磷酸酶活动，也可能会阻断IRF。Nsp16阻断对病毒的RNA识别。SARS的 M蛋白也会阻断IRAK抗体。

这些数据虽然是针对SARS和MERS所做的研究，但可能对新冠也是适用的。很多非结构蛋白都会阻断I-型干扰素响应，磷酸酶和脱磷酸酶作为蛋白活性的开关系统，也可能会阻断I型干扰素响应，有些通过RIG-I机制或MDA5来阻断近端RNA。有些在转译水平上发生作用，阻断ISG（ interferon-stimulated gene 干扰素刺激基因）的表达。有些SARS的M蛋白会在这里阻断IRAK（指图的上部）。所有这些病毒的共同工作机制，就是关闭天生免疫系统对病毒状态的响应。总之，SARS和MERS病毒会限制人体的天生免疫响应。

病毒感染引起的炎症反应有两种。一种是致病性的紊乱炎症反应，另一种是正常的保护性炎症反应。图40清楚地解释了这两种炎症的发生过程。

Figure40 病毒感染的炎症反应

对于紊乱的炎症反应，病毒在体内大量复制并推迟了干扰素的响应。炎症的单核巨噬细胞和嗜中性粒细胞渗透大大加强，前炎性细胞因子和趋化因子大幅升高。这些会造成上皮和内皮细胞死亡，增加血管渗透，T细胞和抗体不能产生正常响应，因而也无法有效清除病毒。这样说产生的后果会造成肺部严重受伤，出现急性呼吸窘迫综合症并导致死亡。

对于正常的炎症反应，病毒在体内只有轻度复制，早期就会出现干扰素响应，炎症的单核巨噬细胞和嗜中性粒细胞只有轻微渗透，前炎性细胞因子和趋化因子也只有轻微上升。这样，上皮和内皮细胞不会出现大量死亡，血管渗透也很少，T细胞和抗体响应反应良好，因而可以有效清除病毒。如此，病人可以获得保护性免疫并最终康复。

下图是对紊乱型天生免疫响应所做的病理分析。

Figure41 紊乱的天生免疫响应的病理分析

可以看到，因大量细胞产生病变效应，产生了大量单核细胞和中性细胞在肺部的炎症响应，这是一种免疫系统疾病。新冠病毒造成大量细胞死亡（Apoptosis）和焦亡（Pyroptosis），并造成ACE2受体的下调和脱落。这些的共同作用使得在发生初级炎症反应时，细胞因子和趋化因子得到释放，抗病毒因子得到表达，造成肺部被病毒侵入，血管渗透性增加，淋巴球减少和RAS功能发生障碍。

病毒的中合抗体（Virus NAb，neutralizing antibody）激活了抗体的Fc受体，使得巨噬细胞响应发生偏移和创伤愈合反应丧失，并产生单核细胞趋化蛋白（MCP-1，Monocyte chemoattractant protein-1, ）和白细胞介素8 （IL-8）。而且中和抗体激活补体系统（complement system）和抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用（ADCC，antibody dependent cellular cytotoxicity）都会对细胞造成损伤。

天生免疫系统的紊乱性炎症反应造成的结果是出现肺炎和急性呼吸道炎症（ARDS），这和与其他类型的ARDS很相似，并产生各种细胞因子风暴（Cytokine Storm）。单核细胞和中性细胞对肺部的侵犯造成肺部表皮脱落和上皮屏障丧失，出现水肿，氧交换不足，造成严重的肝脏和心脏损伤。

Figure 42 急性呼吸道炎症对肺部的损伤

发生病变的肺部看上去就是这样的。这是典型的急性呼吸道炎症（ARDS），会伴随严重的细胞因子风暴，即各种炎症性的细胞因子风暴。这种损伤不仅仅针对肺部，而且还会影响肝部、心脏等其他组织的损伤。很多死于该病的病人既是死于肺炎，也是死于肌病（ myopathy ）。出现肺部上皮屏障功能丧失，氧气交换不足，这就是为什么病人要上呼吸机的原因。

单核细胞和中性细胞是急性呼吸道炎症造成肺部损伤的主要原因。图43 非常经典地描绘了肺部的损伤状态，作为对比，左边是正常的肺部状态，而右边是受到损伤的肺部状态。右半边可见肺部充满了中性细胞和肺巨噬细胞，肺部的丧失了活性层，严重积水，使得氧气无法交换。

Figure 43 中性细胞和巨噬细胞对肺部的损伤

我想借此感谢我们学校的Aaron Diaz实验室的专家们在这方面的工作。

再来看看新冠病人的病程情况：

Figure44 新冠病程

图44描述了整个感染得病的过程，这是中国在疫情爆发早期做的一项重要研究。病人从感染早期出现发烧和咳嗽，一周后出现呼吸困难，10天后收入急诊室并注射皮质类固醇，20天后转阴，此后出院。对于非幸存者两周后出现急性心脏和肾脏损伤和继发性感染，无法清除病毒，不到20天死亡。

关于新冠疾病的治疗，经常问的2个问题是：如何治疗？和何时治疗？

在感染早期（第一周），在病毒高度复制期，应使用抗病毒方案治疗，应该采用抗病毒、阻止病毒复制并阻止病毒进入的治疗方案，尽量降低病毒载量、防止急性呼吸窘迫症和降低死亡率。

在得病后期（第二周），病毒在细胞内已经释放，当感染已经开始造成免疫系统疾病时，就应该采取调节免疫系统的治疗方案，这时应考虑避免细胞因子风暴，通过调节细胞因子水平防止病人出现免疫系统疾病，并用抗炎症药物减少炎症对肺部和心肌损伤。

这是行内的基本观点，只是要掌握好何时采用抗病毒的方案，何时开始用免疫调节的方案。

还有一个问题是，为什么老年人在这次的新冠流行中病情更严重？我对此有浓厚兴趣，因为我自己也在这个风险组中。并不是说老人容易被感染，其实儿童也同样会被感染，之所以老年人风险大还另有原因。

中国医生今年三月份做了个研究发表在NEJM上，1391个儿童中有12.3%被感染，中位年龄为6.7岁，15.8% 无症状，41.5% 有发烧咳嗽和咽喉红肿症状，但只有1%有肺炎。患重症只有一个孩子，因为他患有白血病。

其实不同年龄组被病毒感染的差异在对猕猴的研究中也有过报道。Saskia L. Smits, et al 在2010年做过一个研究发表在PLOS Pathogens上，研究了猕猴的天生免疫系统对萨斯病毒响应情况。他得出的结论是，老年灵猕猴的天生免疫系统在应对SARS病毒时会比较糟糕。他用6只年轻猕猴和6只老年猕猴做对照实验，如下图：

Figure46 SARS病毒对不同年龄猕猴的影响

Figure 47 猕猴SARS感染对肺部的损伤

可以看出，老猕猴的肺部损伤和病情程度都较为严重。作者将老年猕猴病情严重归因于α干扰素响应较弱。他们在老猕猴一旦感染后立即使用重组α干扰素进行治疗，马上病情就会得到改善，变得和年轻猕猴的恢复差不多。

那么究竟老年人的免疫系统有何不同呢？我认为可能是老年人接触的病原多，经常受到冠状病毒感染，体内的抗体浓度水平高，容易产生ADE反应。可能老年人的天生免疫系统比较弱，产生I-型干扰素的速度很慢。这方面有些人体实验，也有关于免疫反应和慢性炎症相关性的研究。老年人体内的慢性炎症状态的确很多，这些慢性炎症会改变人的天生免疫反应，对慢性炎症的适应都是后转录（post transcriptional)或后基因组(post genomic) 的，出现染色质（Chromatin）修饰这类现象，通过约束天生免疫反应来限制老年人对慢性炎症的反应强度。这也许就是老人或老猴子的一种适应性变化，让天生免疫系统变得弱一些。也可能是T细胞和B细胞的变化造成的。日本做过一个研究，对100岁的老人和50岁老人进行比较，发现老年人的B细胞较少而T细胞被改变了。