作者：覃俊龍 張秀明
單位：深圳市羅湖醫院集團醫學檢驗實驗室
臨床生化檢測系統是指生化分析儀、校準品、試劑和檢驗程序的組合。國外實驗室多采用配套（封閉）檢測系統對病人標本進行檢驗，即生化分析儀、校準品、試劑和檢驗程序形成固定組合並經FDA批准配套使用；國內使用配套檢測系統的實驗室雖逐年增加，但出於成本控制等原因仍有不少實驗室在生化分析儀上根據自身意願選擇校準品、試劑和檢驗程序組成自建檢測系統對病人標本進行檢驗。經FDA批准的配套檢測系統廠商都有嚴格的控制攜帶汙染措施，並進行了全遍歷交叉汙染評估，能有效控制項目之間的攜帶汙染。但自建檢測系統或在配套檢測系統上增加新的檢驗項目，實驗室很難進行項目間的全遍歷交叉汙染評估，項目間的攜帶汙染難以達到有效控制[1]。此外，測試項目增多、儀器設計中加樣量的減少、各類體液樣本的應用、不同抗凝劑的使用等都可能使樣本攜帶汙染髮生新的變化；國內部分實驗室未按照製造商建議進行有效的預防性維護，甚至為了降低成本，造成主要元部件超壽命使用，也是自動生化分析儀攜帶汙染存在或增加的重要原因。因此，控制攜帶汙染仍然是現階段提高生化分析系統檢測結果準確性的重要任務。
一、攜帶汙染的定義
攜帶汙染（carry-over 或 carryover）是指由測量系統將一個檢測樣品反應攜帶到另一個檢測樣品反應的分析物不連續量，由此錯誤地影響了另一個檢測樣品的表現量。某一生化檢測從加樣開始至反應結束、清洗完成的任意過程中殘留的任一物質（可以為生物樣本，也可以為試劑或混合反應液）通過儀器硬件（包括但不限於試劑針、樣品針、反應杯、攪拌杆、管路等）被攜帶到下一個生化檢測反應中，參與反應和/或影響反應進程，並導致檢測結果顯著偏差的過程。生化分析儀的攜帶汙染不可能完全避免，只有當這些反應殘留物對下一個反應結果的影響非常顯著，超過實驗室預設的分析質量標準或影響患者臨床結局時，才被定義為攜帶汙染，需要採取必要的措施。當這樣的攜帶汙染髮生在兩個特定的檢測項目（試劑）之間時，也被稱交叉汙染（cross contamination）。
二、攜帶汙染的來源
1.試劑成分間的直接影響：前一個測定試劑中直接含有後一個測試試劑所要測定的項目, 例如：AMY的試劑1（R1）試劑中含有Ca離子（酶活化劑），當某樣品檢測AMY和Ca項目時，順序是先AMY，後測Ca。因吸取過AMY的R1試劑針上可能沾有殘留的R1試劑，當R1試劑針再吸取Ca試劑時，會引入AMY的R1試劑中含有的Ca離子，這樣對Ca項目的檢測結果可能造成正誤差。常見試劑成分間的直接影響有：（1）GLU（氧化酶法）、TP與ACP試劑中含有較高濃度的鉀（K+ ）；（2）ChE、CHOL、GLU（GOD法）、UA（尿酸酶法）、LD（IFCC法）、HBDH（DGKC法）等試劑中含有磷酸鹽緩衝液；（3）CHOL、TG試劑及HDL-C試劑中含有膽酸鈉；（4）ALT（IFCC法）、（AST）（IFCC法）試劑中含有高活性的LD。以上試劑的成分分別會對K+（紫外酶法）、磷（P）、總膽汁酸（TBA）及LD的測定結果形成干擾，造成交叉汙染。
2.試劑成分間的間接影響：試劑成分參與反應，上一個試劑中含有的某種試劑成分與下一反應所要測定的底物相互作用，因而干擾下一反應的測定結果。例如：Mg2+測定試劑的絡合劑也能與鐵（Fe）結合，影響鐵與鐵絡合劑的結合；直接膽紅素（D-Bil）重氮法試劑與Mg2+試劑中含有EDTA，均能與Ca結合，從而影響Ca的測定；以甘油作為酶保護劑的試劑，會對TG的測定帶來干擾；鈣（MTB法）試劑對K+有負干擾；CHOL試劑中含有膽固醇酯酶，可水解膽固醇酯形成遊離膽固醇，對遊離膽固醇測定造成干擾。
3.反應產物的影響：上一個試劑所引導的反應對下一個項目的反應進程帶來間接的干擾，下一項目所測定的是前後兩個項目反應的綜合作用結果。當上一反應產物為H2O2時，則對以Trinder反應產生顏色的測定結果造成干擾，如UA對CHOL結果的影響，CHOL對CREA（酶法）測定結果的影響，GLU（氧化酶法）對CREA測定結果的影響。CK（NAC法）、CK-MB（NAC法）試劑中含有GLU成分，其分析方法的原理中包含GLU的己糖激酶（HK）反應過程，因此可能對GLU的測定帶來干擾，尤其對GLU的HK法測定可能帶來嚴重干擾。
4.影響反應條件：上一試劑緩衝液成分改變了下一反應的pH環境，從而改變反應速率。例如：TP（雙縮脲法）測定需在pH8～9時，蛋白肽鍵才都能與鹼性銅溶液作用生成紫色反應，若pH＜8，則會導致TP結果偏低，還直接影響球蛋白、白蛋白/ 球蛋白結果；酶活性測定有最適pH，大多數酶反應pH在6.0～7.5之間，ALP、GGT、LDH則在鹼性條件下最適宜；CREA（苦味酸速率法）反應條件為鹼性，果糖胺（動力學法）反應條件為酸性，受到汙染後反應速率會減慢。CREA（酶法）試劑中含有抗壞血酸氧化酶，影響了氧化還原反應的進程，會對TBA（酶循環法）測定結果有影響；D-Bil（釩酸鹽氧化法）試劑中的酒石酸鹽緩衝液會影響ALT活性，對測定結果有負干擾。
三、攜帶汙染的途徑
1.試劑針汙染：一般高速全自動生化分析儀都採用雙試劑針，即所有項目的第一試劑都共用試劑針R1，所有項目的第二試劑都共用試劑針R2。試劑針R1或R2在每吸取一次試劑後都會進行一次清洗，之後會立即吸取下一個項目的試劑。如果儀器清洗能力下降或沒有定期進行維護，試劑針在吸取試劑時會將部分殘留的前一項目試劑成分帶入到後一項目反應杯中，對後一項目檢測結果造成影響。從各個項目設置的參數可知，試劑體積量遠大於樣本體積量，因此試劑針攜帶汙染影響程度會高於樣本針攜帶汙染。
2.攪拌棒汙染：試劑與樣本、第一試劑與第二試劑的混勻需要攪拌棒，而攪拌棒如果清洗不完全或黏附力增加時，殘留試劑可能會對下一檢測結果造成影響。
3.比色杯汙染：生化分析儀的比色杯大體分為兩種，一種是循環使用的（如石英比色杯等），另一種是需要定期更換的（如塑料比色杯等），每個比色杯檢測完畢後，進行自動清洗，然後繼續下一個檢測項目的檢測。當由於各種原因導致某個比色杯清洗不完全或該比色杯老化時，吸附在比色杯上的上一個項目的殘留試劑或者反應物可能會對在這個比色杯中進行的下一個項目的檢測結果造成影響。根據經驗，比色杯的汙染對結果影響最大，因為比色杯最難以清洗乾淨，且在實際工作中難以判斷在該比色杯中檢測的前後測試項目。
4.樣本針汙染：目前大多數全自動生化分析儀採用注射器或定量泵產生負壓，通過樣本針吸取樣本，吸樣後通過一定壓力的清洗水清潔樣本針。當樣本針在清洗不完全或黏附力增加時，樣本殘留可能會對下一相鄰樣本的檢測結果造成影響。
5.清洗系統：目前大多數全自動生化分析儀採用多階清洗劑和清洗水清潔比色杯，當清洗針或乾燥針上有試劑、樣本或反應物殘留，可能會對下一個被清洗比色杯的測定結果造成影響，一般來說清洗系統帶來的攜帶汙染很少，可以忽略。
四、配套檢測系統解決攜帶汙染之道
1.從機理上儘可能去除汙染之源：TC試劑配方中一般含有一種物料（具有提高試劑穩定性和抗脂血干擾的作用）是TBA的檢測底物；而TBA是循環酶法試劑，可將底物信號循環放大（圖1），因此只要有微量的底物殘留，就會對結果產生很大影響，並且從反應曲線上無法看出是否存在汙染。深圳邁瑞公司的TC項目試劑盒，通過優化配方，從根本上解決了交叉汙染問題。
圖1 TBA檢測原理示意圖
2.提高儀器清洗能力阻斷汙染之路：從儀器系統設計到關鍵器部件設計再到清洗時序設計，步步精細化控制交叉汙染，如圖2。不同清洗水溫度對試劑針攜帶汙染的影響不同，隨著清洗水溫度增高，攜帶汙染物殘留體積會降低，且對新舊試劑針的影響程度不同。
圖2 生化分析系統清洗流程
圖3 清洗水溫度對新舊試劑針攜帶汙染的影響
3.完整的項目全遍歷交叉汙染評估：在構建封閉檢測系統時，要對所有開展的項目進行全遍歷交叉汙染篩查，在理論分析的指導下，使用添加法做覆蓋性篩選，再全遍歷實測，一般取偏差<5%，或<1.6SD>
交叉汙染評估中SD的含義與指標定義：評價項目間的交叉汙染時，評估被汙染項目的濃度一般取該項目的醫學決定水平點濃度中的最低濃度點左右的值作為測試濃度（譬如：ALT醫學決定水平點為20U/L、60U/L、300U/L，那麼評估交叉汙染選取樣本濃度為20U/L左右），汙染源項目則取該項目的線性上限濃度值。評估項目交叉汙染時的SD選取被汙染項目基準濃度的批內精密度SD（譬如，ALT為被汙染項目，那麼20U/L左右的濃度值測量10次或20次，計算SD），指標取1.6SD。因Westgard質控規則一般取2SD作為評判結果是否失控的警告限或離群標準，選取2SD的80%作為評估標準，即當被汙染結果小於1.6SD，認為結果與正確值無顯著偏差；我們取偏差小於5%或小於1.6SD，這個指標是比較嚴格的，一般評估交叉汙染的文獻上取10%作為可接受指標[1]。
生化分析系統中其他試劑對鎂離子檢測的攜帶汙染較難控制。各品牌生化儀為降低攜帶汙染對鎂離子測定的影響，設計了多種控制方法。例如：羅氏 COBAS c701 設有12組鎂離子試劑針汙染對，貝克曼同時設有試劑針和攪拌杆的鎂離子汙染對, 邁瑞BS-2000M機型通過提升儀器清洗試劑針、攪拌杆和反應杯的能力，將試劑針、攪拌杆和反應杯對鎂離子的總系統汙染率控制在0.04mmol/L以下，見圖4。
圖4 BS2000生化分析系統鎂被汙染的評估
4.儀器防交叉汙染功能設計與測試流程優化：儀器強大的防交叉汙染功能可以有效避免項目間交叉汙染的發生。在同一樣本內，測試項目根據項目間汙染的情況優化測試順序；在不同樣本間，則可通過設置強化清洗，並且根據項目汙染的特性，智能選擇酸、鹼或去離子水作為清洗劑。羅氏交叉汙染對設置以及清洗劑選擇情況見表1，邁瑞BS-2000M交叉汙染對設置以及清洗劑選擇情況見表2。
五、自建檢測系統攜帶汙分析策略
1.自建檢測系統所面臨的攜帶汙染問題：自建系統所用試劑來源於不同廠家，試劑汙染源成份複雜，通過試劑說明書很難判定試劑項目間是否存在汙染，往往只能靠經驗以及樣本檢測過程中的結果異常去發現項目間交叉汙染並進行規避設置。檢測系統投入使用前，完整地去遍歷所有開展項目間的交叉汙染，工作量大，而且往往需要檢驗人員對儀器的工作流程十分了解。使用過程中增、減項目，又會改變項目的測試順序，也有可能帶來新的交叉汙染。
2.自建檢測系統攜帶汙分析策略：根據生化分析儀攜帶汙染的分析評估及處理方法專家共識[2]試劑攜帶汙染分析思路如下：收集現有的項目交叉汙染的資料，包括但不限於製造商手冊、製造商通告、文獻等，尋找被汙染項目可能受哪些項目的試劑汙染；研究被汙染項目所在的檢測單元的試劑分佈、檢測程序，是否存在已知的“配對”交叉汙染；分析被汙染項目使用相同試劑針、攪拌杆、沖洗頭、比色杯等儀器原件，緊鄰的前一個項目是何項目，分析是否存在汙染的可能；如已有的資料信息和結果信息無法提示到底被哪一個項目的試劑汙染，則可以設計試驗評估與被汙染項目處於相同檢測單元中的所有其他項目試劑是否發生攜帶汙染。
3.自建檢測系統交叉汙染評價方案：以雅培公司Abbott Architect c8000臨床生化分析儀對32個生化項目的交叉汙染評估為例[3]，實驗方案設計見表3。實驗室結果顯示以下項目配對之間不存在交叉汙染：糖-鐵,鐵-糖；血紅蛋白-ALT,ALT-血紅蛋白；膽鹼酯酶-Urea，Urea-膽鹼酯酶；C4-肌酐，肌酐-C4；鋰-膽固醇，膽固醇-鋰；鐵-血紅蛋白，血紅蛋白-鐵。以下項目配對之間存在交叉汙染（攜帶汙染率%）：鐵蛋白-鹼性磷酸酶（-10.7%），鐵蛋白-CK（-10.5%）,鐵蛋白-鐵（-10.7%），CRP-IgM（-15.8%），膽鹼脂酶-總膽紅素（＋15.4%），乳酸-鐵蛋白（-22.9%），尿素-鐵（-10.8%），HDL-二氧化碳（-7.2%），IgA-二氧化碳（-35.4%）。實驗室通過設置額外的水、酸或者鹼清洗後，試劑間的交叉汙染滿足要求。
六、交叉汙染案例分析
某患者曾出現左腳大腳趾關節紅腫及劇烈疼痛，懷疑是痛風的表現，隨即到醫院檢查。與導醫溝通後，得知自己的症狀可能是痛風也可能是風溼免疫系統疾病。在腎內科就診後，心存疑慮的患者又就診於風溼免疫科，醫院當時未開通一卡通，因此患者就拿著兩個科室主診醫生開具的兩份檢測申請又分別在兩個不同的採血窗口進行了採血登記，於是同一病人同時就有了兩份檢測結果，樣本1尿酸（UA） 647μmol/L，樣本2 UA 299μmol/L，兩份樣本結果差距巨大，於是實驗室對兩個不同的測試結果進行驗證。（1）重測兩份樣本，樣本1重測結果644μmol/L ，樣本2重測結果升高至660μmol/L；（2）樣本2（UA 299μmol/L）在科室另外一臺儀器上重測，結果652μmol/L；（3）重測部分其他病人UA樣本，重測結果與第一次測試結果沒有明顯偏差。實驗室判斷樣本2 第一次測試結果不正確。實驗室查看兩個樣本的反應曲線，發現樣本2反應監測點13點後出現了一個明顯的負向反應，樣本1沒有，顯然這個反應受到了干擾。檢查試劑、質控結果均正常，其他樣本測試結果正常，因此懷疑在檢測過程中發生了攜帶汙染。
引起攜帶汙染的原因可能為攪拌棒、試劑針、比色杯以及樣本針等殘留前一個項目的物質，對下一個測試項目造成了干擾。首先懷疑試劑針的攜帶汙染，查閱儀器檢測記錄，可見受干擾的UA測試前進行了LDL-C及CHE測試。實驗室的生化分析儀有兩個測試單元，LDL-C測試被安排在2號測試單元，而UA和CHE同在1號測試單元，可見測試單元1發生了CHE對UA的交叉汙染。實驗室進一步做了交叉汙染確認試驗驗證，隨機選擇了兩個測試樣本，每個樣本分成4管，兩個樣本的測試設置均為先進行一個CHE測試，再按管1~4進行四個尿酸測試，結果見表4 。驗證結果顯示CHE對尿酸檢測存在明顯的負干擾 。實驗室將UA和CHE兩個項目分開放置，一個放置於內圈，一個放置於外圈，使用不同的試劑針加樣，有效避免了兩個項目之間的交叉汙染。
七、小結
生化分析系統交叉汙染，來源多，汙染途徑複雜，分析中往往不容易察覺。廠家配套系統，能夠從試劑配方汙染源頭進行設計控制，提高儀器的清洗能力從而斬斷汙染途徑，並且經過全遍歷評估以及交叉汙染對規避設置，確保配套項目間不產生交叉汙染。開放系統需要使用者自行驗證哪些項目間存在交叉汙染，工作量大，增減項目也會影響交叉汙染，很難完全控制。保持檢測系統的完整性是避免交叉汙染的有效手段，是檢測系統有效性的基本保證。
參考文獻略
注：本文來源於《臨床實驗室》2020年第4期“生化”專題
