小鹿同学 微生态 昨天
导读
近几十年来，抗生素使用的迅速增长和高热量、低纤维饮食的摄入已导致肠道微生物群落的紊乱，使人们更容易患上各种疾病，例如代谢综合征。目前微生物群对产后环境的影响已得到了充分地证明，但其对胚胎期肠道微生物群的影响还知之甚少。尽管越来越多的证据支持了健康与疾病发展起源这一概念，但其潜在机制仍不清楚。在这项研究中，作者探讨了母体肠道菌群对生命后期胚胎发育影响，以及其与代谢综合征发展起源之间的联系。
论文ID
原名：Maternal gut microbiota in pregnancy influences offspring metabolic phenotype in mice
译名：孕妇母体肠道菌群影响小鼠后代代谢表型
期刊：Science
IF：41.037
发表时间：2020年2月28日
通讯作者：Ikuo Kimura & Koji Hase
通讯作者单位：东京农业技术大学农学院应用生物科学系&庆应义塾大学药学研究科生物化学部
实验设计
为了研究孕期母体肠道菌群对后代的影响，研究者首先将怀孕小鼠在无特定病原体（SPF）和无菌（GF）的条件下产仔，统一高脂肪饮食饲喂生长后，通过组织学、生化分析、CT成像等手段对小鼠后代的出生体重、肾周及皮下白色脂肪组织以及肝脏重量、血浆内血糖、甘油三酸酯、非酯化脂肪酸、总胆固醇、胰岛素水平等参数进行比较，同时结合16S rDNA测序对小鼠后代的肠道菌群进行分析，从而确定GF后代在高脂肪饮食条件下更容易出现肥胖症；接着研究者通过气相色谱-质谱鉴定等手段对SPF和GF条件下母体和胚胎的血浆中代谢物（短链脂肪酸）进行检测、比较分析，结合交感神经细胞系、胰腺细胞系和肠道类器官等体外实验，确定了短链脂肪酸-GPR41/43轴与交感神经系统的发育、肠内分泌细胞和胰腺β细胞的分化之间的关系；最后，研究者对相同遗传背景的小鼠进行了一项高/低纤维饮食干预研究，代谢组分析显示低纤维饮食干预的小鼠后代具有与GF后代相似的生化指标参数，都出现易肥胖表型。在此基础之上，研究者对低纤维饮食干预的孕期母体进行了短链脂肪酸（丙酸盐）的补充，发现其后代对肥胖也具有抗性。
结果
无菌（GF）母体的后代与肥胖症的发展
为了研究怀孕期间母体肠道菌群对后代的影响，怀孕小鼠在无特定病原体（SPF）和无菌（GF）条件下产仔。在妊娠的第18.5天，怀孕的GF小鼠接受一个从相应菌株的SPF小鼠体内移植的粪便微生物群，以防止不利微生物的过度生长。新生小鼠被寄养母鼠在常规条件下饲养，从而统一出生后的生长环境。断奶后，雄性小鼠被饲喂高脂肪食物（HFD）从而诱导肥胖（图1A）。尽管来自GF ICR母体的新生小鼠在出生后的体重小于来自SPF ICR母体的新生小鼠体重，但是在HFD饮食条件下GF母体的后代会出现明显的肥胖（图1A）。此外，在16周时GF母体的后代（GF后代）肾周或皮下白色脂肪组织（WAT）以及肝脏的重量显著高于SPF母体的后代（SPF后代）（图1A），这与WAT脂肪细胞大小和肝脏的甘油三酸酯（TGs）的增加相一致。同时，GF后代中血糖、TGs、非酯化脂肪酸（NEFAs）和总胆固醇的水平也显著升高（图1B）。GF后代的体温和心率显著降低（图1C），其血浆胰岛素的水平和胰岛大小显著高于SPF后代。此外，GF后代出现食物摄入量的增加，而肠道激素肽YY（PYY）和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的血浆水平降低（图1D）以及能量消耗的减少（图1E）。这些结果表明，GF后代在HFD饲喂条件下表现出肥胖表型。支持该解释的是，GF后代在HFD诱导条件下出现葡萄糖不耐症和胰岛素耐受性的速度显著增加（图1F），表明其胰岛素敏感性受到了损害。值得注意的是，雌性GF后代也表现出相似的表型。
图1. 来自GF母体的后代在饲喂HFD后表现出严重的肥胖表型。（A）实验方案（左）。HFD试验期间的体重变化（中）（每组中n = 14）和组织重量（右）（每组中n = 7~9）。epi：附睾；peri：肾周；sub：皮下注射。（B）血糖、TGs、NEFAs以及总胆固醇的水平（每组中n = 6~11）。mEq：毫克当量。（C）体温（左）（每组中n=7或8）和心率（右）（每组中n=7）。（D）肠道激素PYY的水平（左）（每组中n=6或8）和GLP-1的水平（右）（每组中n=6）。（E）能量消耗（每组中n=7或8）。（F）葡萄糖耐量测试（左）和胰岛素耐量测试（右）（每组中n = 8）。在雄性小鼠16周龄时对其进行了分析。Student’s t-检验，**P<0.01>
哺乳动物新生儿最初暴露于阴道微生物群中，这很大程度上促进了婴儿肠道微生物群落的建立，因此也潜在地影响宿主代谢系统的发育。然而，16S核糖体DNA（rDNA）扩增子测序表明，成年后SPF和GF ICR母体后代构成的肠道菌群的细菌家族的相对丰度相似，尽管与SPF后代相比，婴儿期GF后代的链球菌科和肠球菌科的丰度显著减少。基于加权UniFrac距离的主坐标分析证实，两组在成年期之间没有差异，但在婴儿期存在差异。为了排除阴道微生物群的可能影响，SPF和GF母体的新生儿通过剖宫产的方式分娩。与阴道分娩的后代情况一致，剖宫产GF后代在生长过程中喂食HFD也会表现出严重肥胖表型。剖宫产的GF后代在16周时的WAT和肝脏重量、血浆代谢参数和胰岛素水平也显著高于剖宫产的SPF后代。此外，前者显示出能源消耗的减少。此外，成年期SPF和GF母体的剖宫产后代的肠道菌群组成相似，而分娩方式可能会轻微地影响婴儿期的菌群，这与最近的一项研究发现一致。总体而言，这些数据表明，成年后的肠道菌群并不是GF后代出现易肥胖表型的主要因素。
肠道菌群和宿主遗传学之间的相互作用调节了肥胖的易感性，而饮食等环境因素对于调节宿主与微生物的相互作用是必不可少的。尽管ICR和C57BL/6J母体的后代之间肠道微生物组成趋于不同，但它们显示出相似的肥胖表型（图1，A至F）。此外，来自C57BL/6J母体的雌性和雄性GF后代在喂食HFD时均出现严重的肥胖和代谢紊乱。因此，在或多或少的程度上，研究者可以普遍观察到GF后代的代谢紊乱与小鼠谱系和性别无关。
检测胚胎中的母体短链脂肪酸（SCFAs）
研究者在本实验动物设施条件下无法于怀孕的SPF ICR小鼠羊水中检测到细菌。研究者假设源自母体肠道菌群的代谢信号可能会转移到胎儿体内并影响其代谢系统的发育。因此，研究者分析了SPF和GF ICR母体及其胚胎在怀孕期间的亲水性和亲脂性代谢物的血浆水平。在SPF和GF组之间，母体中5种代谢物的水平显著不同，而胚胎中有12种代谢物；其中，在母体和胚胎中只有5种代谢物在响应饲养条件时表现出相似的变化（图2A）。比较特别的是，GF母体和胚胎中SCFAs（醋酸盐、丙酸盐和丁酸盐）的血浆水平明显低于SPF中对应物的血浆水平（图2B）。考虑到怀孕期间SPF组中母体和胚胎内SCFAs血浆水平都是恒定的，那么母体肠道菌群似乎可以通过血液向胚胎提供SCFAs。
图2. 胚胎的SCFAs依赖于母体肠道菌群，而其受体已在胚胎期表达。（A）火山图显示了母体中或来自ICR SPF和GF母体的胚胎中血浆代谢产物相对丰度差异的显著性和重要性（每组母体的血浆样品n = 5；每组胚胎的血浆样品n = 5）。（B）通过气相色谱-质谱法（GC-MS）鉴定血浆SCFAs的水平（每组母体（Mo）的血浆样品n=8，每组胚胎的血浆样品n=8）。（C）颈上神经节生长期间G蛋白偶联受体41（Gpr41）、酪氨酸羟化酶（Th）、巢蛋白（Nes）、胶质原纤维酸性蛋白（Gfap）的表达（每组中n=8）。（D）生长过程中结肠Gpr41、Gpr43、Gcg、Pax4和Pax6的表达（每组中n=7或8）。（E）生长过程中胰腺Gpr41、Gpr43、Ins2和Nkx6.1的表达（每组中n=7或8）。（C）图到（E）图中相对于18S rRNA基因的表达来表示数值。（B）图中进行Student’s t检验，**P<0.01>
已有研究报道肠道微生物的SCFAs通过激活GPR41和GPR43来调节宿主的能量代谢。研究者在胚胎的交感神经节（图2C）中检测到了Gpr41 mRNA，并且其在胚胎期和成年期呈双相表达（图2C）。这种表达模式在巢蛋白（Nes；一种未分化的神经标志物）、酪氨酸羟化酶（Th；一种交感神经元的标志物）或胶质原纤维酸性蛋白（Gfap；一种神经胶质标志物）中并未观察到（图2C）。同时，从胚胎第15.5天（E15.5）开始在肠道中检测到Gpr43mRNA，尽管在先前的报道中，它的表达仅限于成年期的肠内分泌细胞中。在胚胎期和成年期的结肠内都观察到Gpr43表达的双相增加，其表达高峰期晚于Pax4和Pax6（肠道内分泌细胞分化的调节剂），并且其与Gcg（肠道内分泌细胞的生产者，GLP-1）在相似的时间点出现（图2D）。这些SCFAs受体也在胰腺中表达，并调节成年小鼠的胰岛素分泌。在围产期和产后期之间，胰腺的Gpr43 mRNA（而非Gpr41）会出现瞬时升高，其表达峰值晚于Nkx6.1（早期β细胞分化的相关因子），并与Ins2（胰腺β细胞的生产者）在相似的时间点表达（图2E）。值得注意的是，尽管GF和SPF这两组的胚胎交感神经节中的Gpr41 mRNA表达相似，但GF胚胎内结肠和胰腺中的Gpr43 mRNA的表达水平均显著低于SPF胚胎内的情况。这些发现表明，胚胎的代谢组织，比如交感神经系统、肠道和胰腺，可能通过表达GPR41和GPR43来感知母体肠道微生物衍生的SCFAs。
通过GPR41促进交感神经系的发育
研究者进一步调查了GPR41在交感神经系统中的功能以及GPR43在胚胎发育期间肠道和胰腺中的功能。研究者发现与野生型（WT）的胚胎相比，Gpr41-/-C57BL/6J胚胎中交感神经投射到心脏的现象明显减少，并且这种异常现象在具有相同背景的GF胚胎中也很明显（图3A）。而且，在出生后1天（P1）的Gpr41-/-幼崽中交感神经投射到心脏的现象也明显减少了，即使这些幼崽是被SPF条件下饲喂的母体分娩出来的（图3B）。对于WT小鼠、Gpr41-/-小鼠和Gpr43-/-怀孕的C57BL/6J小鼠，它们的肠道微生物组成相似。血浆的SCFAs水平在三组之间也基本相当。
图3. 丙酸盐通过胚胎GPR41促进交感神经元的分化。（A）E18.5时整个心脏中TH的表达（每组中n=7或8）和具有代表性的Western印迹。（B）交感神经投射到P1整个心脏（上图）（TH免疫染色）以及心室（下图）（TH，绿色；DAPI，蓝色）。TH密度的定量（每组中n=9或10）。（C）丙酸盐（1mM）对Gpr41-/-小鼠中交感神经元分化的影响（TH：红色；DAPI：蓝色；每种条件下进行三个生物学重复，且每个独立实验中n=10）。（D）通过Western印迹来定量P1心室内神经元投射的发育（每组中n=8或11）以及代表性的Western印迹。Abx：抗生素处理。（E）4周龄后代的心率（左）（每组中n=7~11）和体温（右）（每组中n=8）。（F）4周龄后代的能量消耗（每组中n=8）。Student’s t检验（图（A）和图（B））以及Tukey–Kramer’s检验（图（C）~图（F））；**P<0.01>
研究者进一步试图探讨GPR41信号传导对交感神经元分化的贡献。在胚胎颈上神经节（SCG）-衍生的神经细胞的原始培养中，每个检测的SCFAs（尤其是丙酸盐）都显著促进交感神经元的分化。这一发现与以下观点一致：GPR41最有效的兴奋剂是丙酸盐，其次是丁酸盐和乙酸盐，它们的有效中浓度（EC50）值分别约为10、40和2000 μM。丙酸盐诱导的交感神经元分化在来自Gpr41-/-小鼠胚胎的交感神经元细胞中被消除（图3C）。此外，Gi/o-介导（而不是Gi/oα-介导）的GPR41丙酸盐信号通过Gβγ-介导丝裂原活化蛋白激酶的活化从而增加交感神经突的长度。这些发现充分表明丙酸盐介导的GPR41活化促进了交感神经元的分化。为了验证这一观点，研究者使用抗生素混合物处理了WT怀孕的小鼠，以清除其肠道菌群。在P1时期经抗生素处理的小鼠幼崽中交感神经对心脏的投射明显减弱了。值得注意的是，怀孕期间服用丙酸盐可改善这种异常（图3D）。断奶后的心律和体温是交感神经投射的指标，其与耗氧量展现出相似的趋势（图3，E和F）。酪胺处理显著降低了来自未处理、丙酸盐处理或抗生素处理等WT母体的后代耗氧量，而这些影响在来自抗生素处理的WT母体或未处理的Gpr41-/-母体的后代中减弱了（图3F）。基于这些观察，研究者认为来自母体肠道菌群的丙酸盐可以通过GPR41促进交感神经的发育。丙酸盐的缺乏导致交感神经的功能障碍，包括体温降低和心率波动，这与在GF后代中观察到的现象相似（图1C）。
通过GPR43进行胚胎胰岛素的调节
GPR43在成人的肠内分泌L细胞中表达，并在激活后促进肠道激素的分泌。因为在胚胎结肠中也检测到了Gpr43，所以研究者调查了GPR43在胚胎期对肠内分泌细胞分化的影响。与WT胚胎相比，Pax4和Pax6在Gpr43-/-C57BL/6J胚胎的结肠中出现明显上调（图4A）。此类变化在具有相同遗传背景的GF胚胎中也观察到了。相比之下，Gcg和GLP-1在Gpr43-/-和GF小鼠中被下调（图4A）。该结果表明在Gpr43-/-和GF小鼠中肠内分泌细胞的分化出现了延迟。为了直接评估SCFA-GPR43轴在肠内分泌细胞分化中的作用，研究者利用了肠道类器官，其通过减少典型的Wnt信号传导概括了体内的细胞分化。丙酸盐（EC50：~ 30 μM）是一种比乙酸盐或丁酸盐（EC50：分别为~50或100 μM）更有效的GPR43配体，其可以显著促进来自WT胚胎的肠道类器官内GLP-1 +肠内分泌细胞的分化（图4，B和C）。与之形成鲜明对比的是，这种作用在Gpr43-/-胚胎的类器官中消失了（图4，B和C）。值得注意的是，丙酸盐对肠内分泌细胞分化的影响在成年WT小鼠的类器官中并未观察到，说明丙酸盐介导的GPR43信号传导是产前期肠内分泌细胞发育的先决条件。
图4. 丙酸盐通过胚胎GPR43促进肠内分泌细胞和胰腺β细胞的分化。（A）结肠（E18.5）中Pax4、Pax6和GcgmRNA的表达和GLP-1蛋白的水平（每组中n=7或8）。（B和C）在Wnt存在（+）或不存在（-）及GPR43配体（图（B）：1mM和10mM的丙酸盐；图（C）：100μM的丙酸盐）对胚胎类器官（E15.5）处理24h后的Gcg表达（B）和GLP-1-阳性细胞的分布（C）。GLP-1：绿色；DAPI：蓝色；每个条件下进行两个生物学重复，且独立实验中n=5~7。（D）小鼠胰腺（E18.5）中Nkx6.1和Ins2mRNA的表达以及胰岛素蛋白水平（每组中n=7或8）。（E）在GPR43配体（10μM PA-1H，1mM丙酸盐）存在或不存在情况下处理72小时后的Ins2的表达（左）、胰岛素的定位（中；免疫染色）以及胰岛素阳性细胞的数目（右）（胰岛素：绿色；DAPI：蓝色；每个条件下进行两次或三次生物学重复，且独立实验中n=4~10）。为了诱导β细胞分化，将细胞与乙胞素和激活素A进行共培养。（F）母体和E18.5胚胎中血浆胰岛素水平（左）和血浆葡萄糖水平（右）（每组母体的血浆样本n=8，胚胎血浆样本n=8）。图（A），（D）和（F）中分析的GF和SPF小鼠具有C57BL/6J遗传背景。Student’s t检验（图（A）,（D）和（F））以及Tukey–Kramer’s检验（图（B）和（F））；**P<0.01>
因为GPR43调节胰腺β细胞中胰岛素的分泌，且该受体在围产期-产后期这个期间的胰腺中表达（图2E），所以研究者随后调查了GPR43在胚胎发育过程中对β细胞分化的影响。与WT和SPF小鼠中的情况相比，分别来自Gpr43-/-和GF小鼠的胚胎胰腺中Nkx6.1均显著上调，而Gpr43-/-和GF小鼠内Ins2的表达和胰岛素水平均下调（图4D）。此外，在诱导鼠胰腺肿瘤细胞系AR42J分化为β细胞的过程中，Gpr43mRNA的表达水平与Ins2 mRNA的一致，都显著提高，而Gpr41 mRNA的表达水平却没有提高。值得注意的是，丙酸盐和合成的GPR43兴奋剂苯乙酰胺-1（PA-1）促进了向胰岛素+β细胞的分化。然而，这种作用被RNA干扰介导的Gpr43敲除削弱了（图4E）。因此，丙酸盐介导的GPR43激活促进了胰腺β细胞和GLP-1阳性肠内分泌细胞的分化。GF ICR和GF C57BL/6J的胚胎在交感神经元、肠内分泌细胞和胰腺β细胞的分化和功能标记中也表现出异常。
这些发现增加了这个可能性，即SCFA-GPR43信号传导在胚胎胰岛素分泌的过程中可能起重要作用。尽管WT和Gpr43-/-母体之间没有差异，但Gpr43-/-胚胎中的血浆胰岛素水平明显低于WT胚胎内的情况（图4F）。同样，在GF胚胎中也观察到了胰岛素水平的降低。相应地，Gpr43-/-（图4F）和GF胚胎中的血浆葡萄糖水平要显著高于其对照组的水平。鉴于胎儿葡萄糖水平的失调使后代易患代谢综合征（例如肥胖症和Ⅱ型糖尿病），研究者推测产前期SCFA-GPR43信号传导的缺乏会导致成年期的代谢综合征，其很可能是通过损害胚胎的能量稳态来实现。在Gpr41-/- Gpr43-/-双突变C57BL/6J小鼠中，这种交感神经、肠道和胰腺等分化的阻滞现象也很明显。
怀孕期间膳食纤维的摄入
为了提供SCFAs在肥胖抗性形成起因中重要性的进一步证据，研究者进行了一项饮食干预研究，即在常规条件下给怀孕的ICR小鼠饲喂高纤维（HFi）或低纤维（LFi）的食物，随后检测其后代对肥胖的敏感性（图5A）。尽管来自饲喂HFi母体的后代（HFi后代）产后体重明显高于饲喂LFi母体后代（LFi后代）的产后体重，但HFi的摄入抑制了从13周龄以后HFD引起的体重增加，这与皮下WAT和肝脏重量的减少现象一致（图5A）。然而，当对怀孕小鼠施用抗生素以除去肠道菌群时，HFi饮食的作用消失了（图5A），这表明膳食纤维的微生物发酵有助于抑制肥胖。与LFi后代相比，HFi后代中的血浆代谢参数也得到了改善。同样，HFi后代对HFD引起的葡萄糖不耐症和胰岛素耐受性具有抵抗力，这与能量消耗的改善有关。此外，LFi后代中出现的交感神经功能障碍现象（比如体温降低和心率波动）在HFi后代中都得到了改善（图5C）。成年期LFi后代和HFi后代的肠道菌群组成类似，但婴儿期两组之间的肠道菌群组成却存在显著差异。研究者对母体和胚胎血浆样品的代谢组分析显示：在LFi-和HFi-饲喂组之间分别有11和4种代谢物发生了显著变化，而在HFi-饲喂的母体及其胚胎中有4种代谢物通常增加（图5D）。在这4种代谢物中，SCFAs是在SPF与GF和LFi与HFi的比较中唯一的共同因素。HFi-饲喂小鼠的胚胎（HFi胚胎）中SCFA的水平显著高于LFi-饲喂小鼠的胚胎（LFi胚胎）内的情况（图5E）。研究者还观察到，HFi胚胎中的血浆胰岛素水平显著高于LFi胚胎的水平（图5F），从而HFi胚胎中的血浆葡萄糖水平出现显著降低（图5F）。因此，母体肠道菌群通过膳食纤维发酵产生的SCFAs通过母体循环提供给胚胎，从而改善胎儿的葡萄糖稳态，并赋予后代抵抗肥胖的能力。
图5.怀孕母体的膳食纤维补充会导致后代对肥胖产生抵抗力。（A）实验方案（左）。HFD试验中的体重变化（中；每组中n=8~13）。组织的重量（右；每组中n=8~13）。（B）血浆葡萄糖、TGs、NEFAs以及总胆固醇的水平（每组中n=8~10）。（C）体温（左；每组中n=7或8）和心率（右；每组中n=8或10）。（D）火山图显示母体中及来自LFi和HFi母体的胚胎中血浆代谢物相对丰度差异的重要性和意义（每组中母体血浆样本n=5，胚胎血浆样本n=5）。1：半乳糖。（E）通过GC-MS鉴定血浆SCFAs（每组中母体血浆样本n=8，胚胎血浆样本n=8）。（F）母体及E18.5胚胎中的血浆胰岛素水平（左）和血浆葡萄糖水平（右）（每组中母体血浆样本n=8，胚胎血浆样本n=8）。图（A）~（C）中在雄性小鼠16周龄时对其进行分析。Student’s t检验（图（B）,（C），（E）和（F））以及Tukey–Kramer’s检验（图（A））；HFi与LFi时，**P<0.01>
怀孕期间SCFA的补充
HFi胚胎中血浆丙酸盐的水平可能足以激活GPR41和/或GPR43受体，鉴于血浆丙酸盐的检测值优于EC50值（图5E）。正子断层扫描（PET）成像显示，结肠腔内[11C]-标记的丙酸盐在输入40分钟内通过母体的肝脏和血流到达胚胎。因此，为了严格检验丙酸盐在后代拥有肥胖抗性中的作用，研究者给怀孕ICR小鼠饲喂补充了丙酸盐的LFi食物（图6A）。这种食物的摄入会提高母体和胚胎内血浆的丙酸盐水平。丙酸盐的补充处理抑制了HFD引起的成年后代的体重、肾周或皮下WAT数量以及肝脏重量的增加（图6A）。与对照组的LFi后代相比，丙酸盐处理后的母体后代（Pro后代）的血浆代谢参数也得到了改善（图6B）。在Pro后代中，HFD引起的葡萄糖不耐症和胰岛素抗性得到了明显改善，且其能量消耗也改善了。此外，Pro后代恢复了LFi后代中出现的交感神经功能障碍现象（图6C）。在婴儿期和成年期中，LFi后代和Pro后代之间的肠道菌群组成相似。此外，母体的丙酸盐干预措施逆转了饲喂LFi的母体胚胎中交感神经向心脏的投射阻滞以及GLP-1 +肠内分泌细胞和胰腺β细胞的分化延迟（图6，D和E）；它也提高了胚胎中血浆胰岛素的水平，使其恢复到与HFi胚胎内相当的水平（图6F）。因此，补充丙酸盐母体的胚胎中有效抑制了对照组胚胎的血浆葡萄糖水平增加的现象（图6F）。与接受抗生素处理且饲喂HFi的母体后代情况一致，饲喂HFi的GF ICR母体的后代重现了易肥胖表型，该表型在怀孕期间通过施用丙酸盐来避免。这些发现共同定义了母体丙酸盐的重要性，其使后代对肥胖具有抵抗力。
图6.怀孕母体的丙酸盐补充会导致后代对肥胖产生抵抗力。（A）实验方案（左）。HFD试验中的体重变化（中；每组中n=11~13）。组织的重量（右；每组中n=11~13）。（B）血浆葡萄糖、TGs、NEFAs以及总胆固醇的水平（每组中n=8~13）。（C）体温（左；每组中n=6或8）和心率（右；每组中n=6或9）。（D）E18.5时整个心脏中TH的表达（每组中n=8）和代表性的Western印迹。（E）结肠（E18.5）中Gcg mRNA的表达以及GLP-1蛋白水平（左；每组中n=8）。胰腺（E18.5）中Ins2 mRNA的表达以及胰岛素蛋白水平（右；每组中n=8）。（F）E18.5时母体和胚胎的血浆胰岛素水平（左；每组中母体血浆样本n=8，胚胎血浆样本n=8）和血浆葡萄糖水平（右；每组中母体血浆样本n=8，胚胎血浆样本n=8）。图（A）~（C）中在小鼠16周龄时对雄性小鼠进行分析。Student’s t检验（图（A）~（F））; **P<0.01>
讨论
在这项研究中，作者认为怀孕期间母体的肠道菌群可通过SCFA-GPR41和SCFA-GPR43轴赋予后代对抵抗肥胖的能力。怀孕期间，胚胎的交感神经、肠道和胰腺中的GPR41和GPR43可以感知到来自母体肠道菌群的SCFAs。已知SCFAs通过多种机制能够发挥多效作用，比如丁酸盐对组蛋白去乙酰基酶（HDAC）的抑制作用（半抑制浓度（IC50）：~90至170μM）、丁酸盐对GPR109A的激活（EC50：~700μM）、乙酸盐（EC50：~2300μM）和丙酸盐（EC50：~1000 μM）对Olfr78（嗅觉感受器）的激活。考虑到胚胎循环的血浆中SCFAs的浓度较低（乙酸盐：~400μM；丙酸盐：~50μM和丁酸盐：~10μM），SCFAs不太可能与Olfr78和GPR109A互作。同时，SCFAs的浓度足以激活GPR41和GPR43。SCFAs对胚胎GPR41和GPR43的激活促进了交感神经元、肠内分泌细胞和胰腺β细胞的分化，这对于通过交感神经系统和胎儿葡萄糖稳态来维持的能量稳态（例如产热和心率）至关重要。此外，鉴于在GF后代的胰腺和结肠中Gpr43的表达趋于下调，SCFAs（如丁酸盐和丙酸盐，也可作为HDAC的一种抑制剂）可通过表观遗传修饰调节Gpr41和Gpr43的基因表达来调节胚胎发育。
除SCFAs以外的其它几种代谢物在SCF和GF条件下母体和胚胎的血浆中也表现出相似的变化。但是，与饲喂LFi的母体及其胚胎中的情况相比，在饲喂HFi的母体及其胚胎中通常仅SCFAs提高了。使用丙酸盐处理LFi饲喂的母体可修复胚胎中肠内分泌细胞和交感神经元的分化缺陷，但是在Gpr41和Gpr43敲除的情况下丙酸盐的修复作用消失了。这些观察结果强调了SCFA-GPR41和SCFA-GPR43轴在新陈代谢和神经系统的产前发育中所做出的贡献。此外，尽管来自GF-ICR和GF-C57BL/6J母体的后代出现了肥胖症，但两组之间肥胖症表型的严重程度稍有不同。这种差异可归因于肠道微生物的组成，其受宿主遗传背景的影响很大。与此观念一致的是，研究者发现ICR和C57BL/6J母体之间的血浆SCFA水平有所不同（图2B）。
尽管SPF和GF后代在成年期的肠道菌群组成相似，但这两组的肠道菌群在婴儿期的组成却不同。与LFi后代相比，在HFi后代的婴儿期也观察到了类似趋势，这增加了婴儿期微生物群的改变在一定程度上促进GF和LFi后代肥胖表型发展的可能性。然而，对怀孕的LFi母体施用丙酸盐可以改善后代易肥胖的表型，且不会影响婴儿期后代的微生物群。此外，丙酸盐处理还改善了GF胚胎中的高血糖症，并降低了LFi和GF后代的能量消耗。尽管GPR41缺乏症也会导致较低的能量消耗，但怀孕期间施用丙酸盐并不能预防该表型。基于这些观察结果，研究者认为母体微生物衍生的SCFAs（尤其是丙酸盐）在预防后代代谢失调的发展中起着至关重要的作用。同时，应该注意的是，GF后代在光周期和暗周期中都表现出能量消耗的异常，而LFi后代仅在暗周期中表现出异常的能量消耗。因此，研究者并不能正式地排除这个可能性，即肠道菌群和/或其产物（SCFAs以外）的存在可能有助于增加光周期时的能量消耗。
GF母体胚胎中胰岛素的调节受到损害，且成年期胰岛素水平显著升高。成年GF后代中胰岛素水平过高很可能归因于一种代谢适应，即对出生体重低和胰腺β细胞分化延迟的响应，最终增加了HFD饲喂条件下后代对肥胖的敏感性。这种异常使人想起追赶性增长，正如多项出生队列的研究证明的一样，小于胎龄（SGA）出生的孩子在以后的生活中面临着体重过度增加和代谢综合征的风险。尽管目前尚不清楚SGA出生的病因，但可能与营养不良、吸烟和饮酒等在内的母体因素有关。研究者进一步提出，肠道微生物群紊乱导致的SCFA缺失可能是SGA出生的另一个致病因素，从而引起追赶性增长和肥胖症易感性。本研究提供了证据，证明孕期母体肠道环境对预防后代出现代谢综合征的代谢程序至关重要。这一发现为通过靶向母体肠道菌群从而抢先治疗代谢性疾病开辟了新的研究途径。
