點評丨李大力（華東師範大學教授）
CRISPR/Cas9基因編輯系統利用Cas9核酸內切酶結合sgRNA對靶DNA進行切割，誘發DNA進行非同源末端連接（Non-homologous End Joining，NHEJ）或同源重組（Homology-directed repair，HDR）損傷修復機制，進而實現靶基因序列突變。2016年，David R. Liu課題組建立了基於CRISPR/Cas9技術的高效誘導單一核苷酸突變的胞嘧啶單鹼基編輯器（BE3），通過nickase Cas9蛋白（nCas9）上偶聯大鼠胞嘧啶脫氨酶（rAPOBEC1），可以將靶位點C•G轉變為T•A【1】。由於該系統避免了傳統CRISPR/Cas9導致DNA雙鏈斷裂可能帶來的損傷，迅速被國內外科學家應用於不同物種的基因編輯。單鹼基編輯系統除可以進行單個氨基酸位點的基因編輯以外，理論上還可以通過氨基酸位點的遺傳篩選進行蛋白結構和功能的在體研究，不過該應用至今未見報道。
中國科學院生物化學與細胞生物學研究所李勁松研究組長期從事小鼠孤雄單倍體胚胎幹細胞及其應用的研究。2012年，李勁松研究組與徐國良研究組合作首次建立了孤雄單倍體胚胎幹細胞，並證明這些細胞能夠代替精子使卵母細胞“受精”產生半克隆小鼠，不過該技術產生半克隆小鼠的效率低下【2】。2015年，李勁松研究組和楊力研究組合作，通過刪除兩個印記調控區域（Differentially Methylated Region, DMR）,
H19-DMR和IG-DMR，獲得了能夠高效產生半克隆小鼠出的孤雄單倍體胚胎幹細胞（“人造精子”）【3】。基於上述前期研究成果，李勁松課題組推測，“人造精子”介導的半克隆技術與BE3技術結合，有可能實現特定蛋白質關鍵氨基酸的在體遺傳篩選。10月1日，Nature Cell Biology 在線發表了中國科學院生物化學與細胞生物學研究所李勁松和陳勇研究組題為CRISPR–Cas9-mediated base-editing screening in mice identifies DND1 amino acids that are critical for primordial germ cell development的最新合作研究成果。該工作利用最新的CRISPR/Cas9介導的單鹼基編輯系統 （BE3 ）結合單倍體胚胎幹細胞（“人造精子”）介導的半克隆技術，對影響小鼠原始生殖細胞（PGCs）發育的重要基因Dnd1實現個體水平氨基酸功能位點的遺傳篩選（Dnd1突變會導致小鼠PGCs缺陷和不育【4】）。
在這些研究中，研究人員首先在小鼠胚胎幹細胞系中，通過鹼基編輯器（BE3）的N端和C端同時加上一個核定位序列，建立了高效的單鹼基編輯系統。之後，他們將該系統應用於小鼠“人造精子”上，發現優化的BE3不僅可以在“人造精子”上實現高效的單鹼基編輯，將攜帶BE3的“人造精子”注入卵子還可以高效地產生純合點突變的半克隆小鼠。緊接著，他們向“人造精子”中導入了一個靶向Dnd1基因的一個sgRNA慢病毒文庫（含77個sgRNA），發現能在半克隆小鼠中高效地誘導不同位點的單鹼基突變。通過兩輪的遺傳篩選，他們發現並驗證DND1的E59K、V60M、P76L和G82R對PGCs的發育具有重要作用（嚴重影響PGCs的形成，下圖）。
之後，通過與陳勇課題組合作，他們通過蛋白結構的預測、突變後蛋白的穩定性、蛋白與蛋白相互作用等多個層次分析發現這些位點對於DND1蛋白質穩定性和其與其它蛋白質相互作用起著關鍵的作用。
示意圖：“人造精子”結合鹼基編輯技術實現蛋白質重要氨基酸的在體遺傳篩選
總的來說，該工作在國際上首次利用鹼基編輯技術實現了個體水平蛋白質關鍵氨基酸功能位點的遺傳篩選，為蛋白質結構和功能的研究開闢了一個新的體系。該體系的另一潛在的重要應用是篩選的人類疾病相關基因的功能位點，並與已有的SNVs數據庫進行比對，預測疾病相關基因的致病位點。
據悉，該工作在李勁松和陳勇研究員的共同指導下，由李勁松組博士生李慶和陳勇組博士後黎顏景等完成。
參考文獻：
1、Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A., & Liu, D. R. (2016). Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 533(7603), 420.
2、Yang, H., Shi, L., Wang, B. A., Liang, D., Zhong, C., Liu, W., ... & Li, J. (2012). Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell, 149(3), 605-617.
3、Zhong, C., Yin, Q., Xie, Z., Bai, M., Dong, R., Tang, W., ... & Li, J. (2015). CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library.
Cell Stem Cell, 17(2), 221-232.4、Youngren, K. K., Coveney, D., Peng, X., Bhattacharya, C., Schmidt, L. S., Nickerson, M. L., ... & Rubin, E. M. (2005). The Ter mutation in the dead end gene causes germ cell loss and testicular germ cell tumours. Nature, 435(7040), 360.
專家點評
李大力（華東師範大學生命科學學院教授）
CRISPR/Cas9技術不僅可以精確的編輯基因改變物種性狀和開展基因治療，利用sgRNA文庫在細胞系或單細胞生物中進行大規模篩選已經成為功能基因篩選的重要研究手段。比如，利用野生型的Cas9和靶向增強子等DNA調控區域的sgRNA文庫，可以解析增強子的功能區域【1】，發現重要毒素的受體基因（北京大學魏文勝課題組）【2】，甚至是鑑定腫瘤免疫治療的新靶點【3】（Dana-Farber 癌症研究所Nicholas Haining實驗室）。而將胞嘧啶或腺苷脫氨酶與Cas9酶活缺陷型（主要是nickase）融合形成的新一代單鹼基編輯工具Base editor（BE）4和adenosine base editor （ABE）【5】，則為單個鹼基分辨率的基因編輯篩選提供了新的可能性。例如，中科院常興課題組等將胞嘧啶脫氨酶AID與Cas9突變體結合，通過sgRNA文庫對抗癌藥物靶蛋白進行單鹼基的飽和突變篩選，發現了新的突變可以產生對靶向藥物的耐藥性【6,7】。
迄今為止，絕大部分的篩選研究都是以細胞系、酵母、細菌等細胞系或單細胞生物作為對象，主要是它們都易於培養，容易控制單個sgRNA進入到一個細胞排除干擾，同時也易於找到合適的篩選體系富集所需要的突變。但是，單細胞的篩選體系無法模擬複雜的生命過程，具有很大的侷限性，然而要想在複雜生物體內和特定發育時期進行篩選技術難度非常大。
上海中科院生化細胞所李勁松課題組利用前期建立的基於孤雄胚胎幹細胞的“半克隆”技術【8】，率先利用BE3單鹼基編輯技術，在小鼠中完成了對生殖細胞發育關鍵蛋白DND1重要氨基酸篩選，發現關鍵位點的單點突變可以導致不育的表型。傳統的通過將BE3 mRNA/sgRNA直接進行胚胎注射的方法所產生的F0代小鼠往往是嵌合型，從F0代得到純和突變動物一般需要兩代，大約需要半年左右的時間，即便對於十數個靶點，繁育不同突變小鼠所需要的時間和工作量都是非常巨大的。
在Nature Cell Biology發表的這篇論文中，李勁松課題組首先通過增加核定位信號對BE3進行了優化，提高了編輯效率。針對DND1蛋白的外顯子設計了約80條sgRNA序列，在孤雄單倍體ES細胞中進行篩選，確定篩選出的細胞能夠包含全部sgRNA序列後進行半克隆小鼠製備。最後發現DND1蛋白上4個關鍵的氨基酸突變（ E59K, V60M, P76L，G82R）導致小鼠無法正常形成原始生殖細胞而導致不孕不育。通過驗證和機制分析，證實突變引起了蛋白質錯誤摺疊，使DND1蛋白穩定性下降並影響了與NANOS2相互作用的能力，從而導致了小鼠的不孕不育。
李勁松老師課題組的這篇論文，以DND1這個關鍵蛋白為例證明了單鹼基編輯結合“半克隆”小鼠技術是解析蛋白質關鍵氨基酸功能的開創性方法。由於人體的許多基因和小鼠具有較高的同源性，運用這一方法，也可以快速規模化地建立精確位點突變小鼠庫，為在整體動物層面驗證GWAS分析所鑑定出的潛在人類疾病關鍵基因的功能性位點提供了可行、可靠的技術路線。
參考文獻
1.Canver, M. C. et al. BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis. Nature 527, 192–197 (2015).
2.Zhou, Y. et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature (2014). doi:10.1038/nature13166
3.Manguso, R. T. et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature (2017). doi:10.1038/nature23270
4.Komor, A. C., Kim, Y. B., Packer, M. S., Zuris, J. A. & Liu, D. R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420–424 (2016).
5.Gaudelli, N. M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature 551, 464–471 (2017).
6.Hess, G. T. et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nat. Methods (2016). doi:10.1038/nmeth.4038
7.Ma, Y. et al. Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells. Nat. Methods 13, 1029–1035 (2016).
8.Yang, H. et al. Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell (2012). doi:10.1016/j.cell.2012.04.002
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