哺乳動物中DNA 6mA去甲基化酶ALKBH1的工作機制

6mA是哺乳動物基因組中除5甲基胞嘧啶及其衍生物（5mC，5hmC，5fC，5caC）之外的又一類表觀修飾，被稱為哺乳動物基因組第九鹼基。基因組6mA的水平在早期胚胎髮育和癌症發生等過程中呈現出劇烈波動，其背後的調控機制是解碼這一新型修飾鹼基生物學功能的關鍵。

2016年，耶魯大學Andrew Xiao教授實驗室曾在Nature發文首次報道ALKBH1具有DNA 6mA的去甲基化酶活力【1】。但自1996年ALKBH1被克隆以來，其生理底物一直存在巨大爭議（相關爭議詳見此前報道：特別推薦丨單分子測序在真核生物DNA甲基化(6mA)檢測中的機遇和挑戰；Mol Cell | 又見新的DNA 6mA催化酶！），相關結構亦未解析，亟待進一步研究，另外也有報道稱ALKBH4是DNA 6mA的去甲基化酶（相關爭議詳見此前報道：Mol Cell | 又見新的DNA 6mA催化酶！）。此外，圍繞DNA 6mA修飾的催化酶很長時間也存在爭議，近日，MD Anderson程曉東團隊在Cell Discovery雜誌上發表文章Human MettL3-MettL14 complex is a sequence specific DNA adenine methyltransferase active on single-strand and unpaired DNA in vitro，揭示了在體外條件下，MettL3-MettL14複合物可催化ssDNA和bubble DNA上特定序列（GGACT）的6mA的修飾，為相關研究提供了新的可能【2】，另外，近日哈佛大學施揚教授團隊在Cell Research上發表文章報道了過去被認為是DNA 6mA催化酶的METTL4實際上是snRNA上m6Am修飾的甲基轉移酶。那麼回過頭來問，ALKBH1如果是DNA 6mA去甲基化酶，那麼其中的機制和結構生物學基礎是什麼呢？

2020年2月12日，清華大學醫學院李海濤研究組與Andrew Xiao教授實驗室在Cell Research期刊以長文形式報道了題為“Mammalian ALKBH1 serves as an N6-mA demethylase of unpairing DNA”（哺乳動物ALKBH1是一類非配對DNA的N6-甲基腺嘌呤去甲基化酶）的研究論文。該研究通過建立穩定可靠的體外酶活檢測體系，首次鑑定出ALKBH1為一類局部非配對DNA的N6-甲基腺嘌呤（6mA）去甲基化酶（圖1）；首次解析了ALKBH1自由態以及與DNA底物的複合物結構，揭示了ALKBH1偏好局部非配對核酸底物的結構基礎，為哺乳動物基因組第九鹼基6mA的調控生物學提供了全新的研究視角。

圖1. ALKBH1偏好局部開鏈DNA並催化6mA的去甲基化

ALKBH1是Fe(II)-α-酮戊二酸雙加氧酶超家族中AlkB家族的成員，與5mC去甲基化酶Tet家族存在很近的親緣關係。在本研究中，研究者首先建立了基於液相-質譜（LC-MS/MS）的定量酶活檢測體系，系統地檢測了ALKBH1對各類核酸底物的去甲基化酶活，發現ALKBH1偏好催化局部開鏈的鼓泡DNA而非單鏈DNA中6mA的去甲基化，且完全無法催化雙鏈底物的去甲基化（圖2）；進一步實驗表明，ALKBH1可以同樣高效催化多種局部非配對核酸（如bulge、R-loop、D-loop和stem loop等）中6mA的去甲基化，而對鹼基序列沒有特別偏好，首次闡明瞭ALKBH1對底物二級結構的高度依賴性。同時，研究者建立的基於寡鏈核酸的質譜測活方法，成功捕獲了6mA去甲基化過程的中間產物N6-羥甲基腺嘌呤（6hmA），為ALKBH1催化的化學機理提供了新證據。6hmA在非酶促條件下，可以穩定存在數小時，提示6hmA有可能作為一種亞穩態表觀修飾參與調控。

圖2. ALKBH1識別與催化非配對DNA 6mA去甲基化的生化結構基礎

其它AlkB家族成員以及Tet家族成員均未表現出對局部非配對核酸的偏好，那麼ALKBH1這種獨特底物偏好的結構基礎是什麼呢？如圖2所示，ALKBH1由位於C端的催化結構域（DSBH）、相鄰的底物識別亞結構域（NRL）以及N端的延長區域（NTE）構成，其中NRL亞結構域又細分為Flip1和Flip2兩部分。研究者首先解析了2.5 Å的ALKBH1自由態結構，發現其Flip1遠離酶活中心且外翻伸展，這與其它AlkB家族成員以及Tet2“回扣式”的Flip1構象形成了鮮明反差。已有研究表明，“回扣式”Flip1構象對於穩定雙鏈DNA修飾鹼基外翻，促使其伸向活性中心完成催化有著重要作用。ALKBH1中Flip1的伸展構象導致其失去了自主外翻DNA鹼基的能力，因此ALKBH1無法催化雙鏈DNA底物，而其酶活發揮需要鹼基的預先翻轉。

隨後，研究者通過定點交聯策略，使原本結合較弱的ALKBH1和凸起DNA底物形成穩定、均一的複合物，並最終在2.4 Å分辨率水平解析了複合物晶體結構（圖2）。結果表明， ALKBH1伸展的Flip1與其N端的α1位於催化中心兩側，分別與翻轉鹼基左右兩側的雙鏈區域互作。其中，α1和Flip1上的R24和R159殘基分別以“精氨酸手指”方式插入雙鏈區域的小溝中，協助將DNA凸起中外翻的修飾鹼基呈遞至催化中心實現去甲基化。複合物結構解析突顯了局部非配對底物雙鏈區在ALKBH1底物識別過程中的關鍵作用，闡明瞭ALKBH1偏好催化局部開鏈核酸底物而非單鏈底物的原因。研究者進一步對小鼠早期胚胎髮育細胞進行DIP-seq以及ssDNA-seq分析，發現N6-mA與基因組的非配對區域存在著顯著的共定位，暗示著N6-mA的調控可能與真核生物染色體高級結構的動態變化密切相關，這將為後續ALKBH1以及N6-mA的功能研究提供全新的視角。

據悉，清華大學李海濤教授以及耶魯大學Andrew Xiao教授為共同通訊作者。李海濤實驗室張敏博士（清華-北京生命科學聯合中心2015級博士研究生）、醫學院博士研究生楊舒敏以及耶魯大學博士研究生Raman Nelakanti為本文共同共同第一作者。第二作者2018級PTN聯合項目博士生趙文濤同學和清華代謝質譜平臺的劉曉蕙老師為本工作的順利開展作出了重要貢獻。

在同期Cell Research上，中國農業大學陳忠周教授與中科院生物物理所閆小雪發表了文章Structural basis of nucleic acid recognition and 6mA demethylation by human ALKBH1，通過晶體結構解析了hALKBH119–369, hALKBH119–369-Mn2+和hALKBH119–369-Mn2+-α-KG結構。hALKBH119–369擁有針對ssDNA上6mA的去甲基化酶活性，但不能參與dsDNA上6mA或者ssDNA上m1A的去甲基化。研究人員還發現儘管hALKBH1可以結合dsDNA，但N-端Flip0結構域（19-32殘基）可以阻止dsDNA進入hALKBH1的活性中心，在其識別特異性底物ssDNA 6mA中扮演了重要作用。

總的來說，相關工作揭示了ALKBH1偏好局部非配對核酸底物的結構基礎，為哺乳動物基因組上極富爭議的6mA修飾的調控生物學提供了新的研究視角。然而，圍繞哺乳動物以及其其它低等生物如線蟲和果蠅中DNA 6mA修飾的生物學意義和功能的爭議並沒有解除，目前圍繞DNA 6mA全基因組檢測的相關方法學上仍然面臨不小的挑戰，該領域仍然亟待更多的研究理清科學的本來面貌。

原文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41422-019-0237-5

https://doi.org/10.1038/s41422-019-0233-9

參考文獻

1. T. P. Wu, T. Wang, M. G. Seetinet al. DNA methylation on N(6)-adenine in mammalian embryonic stem cells. Nature，2016，532（7599）：329-333

2. Clayton B. Woodcock, Xing Zhang and Xiaodong Cheng，Human MettL3–MettL14 complex is a sequencespecific DNA adenine methyltransferase active on single-strand and unpaired DNA in vitro. Cell Discovery (2019) 5:63

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