這是一項囊括了

糞便

活檢組織的人轉錄組、表觀組和16S；

血液樣本的人外顯子組、血清檢查和表觀組。

超級無敵多組學研究，本文章側重報道了腸道微生物的部分研究結果。

快到碗裡來~

文獻速遞

炎症性腸病（IBD）包括克羅恩病（CD）和潰瘍性結腸炎（UC），影響全世界數百萬人。作為整合人類微生物組項目（HMP2或iHMP）的一部分，文章對 132 名受試者進行了為期一年的研究（每個最多 24 個時間點；總共 2,965 個糞便，活組織檢查樣本，和血液標本）。

文章發現患者微生態中兼性厭氧菌特徵的升高是以專性厭氧菌為代價的，同時會影響生物轉錄過程和代謝產物中的分子降解，和宿主血清中的抗體含量。

疾病的週期可以被時間特異變量所標記，包括特異性的物種組成、功能和生化指標。

文章最終確定了這種失調中最核心的微生物、生化指標和宿主因素。

Keywords: IBD,iHMP

Title: Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases

DOI

Journal: Nature [IF 41.577]

First Authors: Jason Lloyd-Price

Correspondence: Curtis Huttenhower

Affiliation: Infectious Disease and Microbiome Program, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA.

Published: 2019-05-30

研究背景

人類基因組中包括 200 多種 IBD 相關的風險變異因子，其中許多是宿主 - 微生物相互作用的結果

IBD 患者腸道微生物組的常見變化包括兼性厭氧菌（包括大腸桿菌）的增加，以及生產短鏈脂肪酸（SCFAs）的專性厭氧菌的減少

研究思路

五個研究人群：三個兒童人群（Cincinnati Children’s Hospital, Massachusetts General Hospital (MGH) Pediatrics, Emory University Hospital）、兩個成人人群（MGH and Cedars-Sinai Medical Center），共 132 個研究對象（圖1a）。

基於初始內窺鏡和組織病理學未被診斷 IBD 的個體被歸類為 “non-IBD” 對照。

共分析了該診所收集的 651 個活檢組織（base-line）和 529 個血液樣本（大約每季度一次），以及 1,785 個糞便樣本（每兩週一次，持續一年）。

糞便樣本：宏基因組（MGX），宏轉錄組（MTX），蛋白質組（MPX），代謝組（MBX）和病毒組（VX）（圖1b）

活檢組織：人 RNA 測序（RNA-seq（HTX）），表觀組學（RRBS），16s

血液樣本：人外顯子測序，血清檢驗，RRBS

最終，得到了 305 個包含全部測量分析數據的結果，791 對 MGX-MTX 的結果（圖1c）。

圖 1. A）全部研究對象的分佈情況；B）所有樣本的收集情況，包括活檢、糞便、血液等；C）不同測量數據之間

研究結果

1.IBD 中的多組學腸道微生態變化

與先前研究一致，主座標分析的第二主座標更能區分 IBD 子集（圖1d），但對於全部的測量數據，個體內的差異解釋了大部分的方差（圖1e,f）。大部分的測量數據在不同的樣研究對象、橫斷面或者時間序列研究上都有相關性（圖1e）。特別是從 MGX, MTX, 和 MPX得到的功能數據聯繫緊密。與預計不符的是，儘管收集了詳盡的跨時間的飲食數據，飲食僅僅能解釋 3% 研究對象間物種上的差異，和 0.7% 時間跨度上的差異。

圖 1. D）所有樣本的PcoA分析；E）Mantel tests量化的各因素對研究對象間和研究對象內方差的貢獻度；F）PER

患者和對照之間最明顯的差異出現在代謝組中（圖1f，2a）。總體而言，患者的代謝組多樣性低，與之前對微生物多樣性的觀察結果一致。可能是由於營養吸收不良、患者的腸道水分或血液過多、在活躍 IBD 患者中食物通過腸道時間較短等原因導致的。

糞便鈣衛蛋白和 Harvey-Bradshaw 指數（HBI）是 CD 中評估嚴重程度的兩個指標，在結果中沒有顯著相關性，而 UC 中的簡單臨床結腸炎活動指數（SCCAI）與糞便鈣衛蛋白水平弱相關（圖2b）。

與之前的研究相悖的是，在進行多項假設檢驗後，IBD 患者和對照組之間沒有顯著差異的宏基因組物種。文章認為這可能是因為參與研究的患者分化為兩種，一種是不太活躍的 IBD（症狀緩解或者最近才發生），另一種 IBD 則更為活躍。文章將與對照組差異非常大樣本稱為“失調”(dysbiotic)樣本（圖2c）。最終得到 78 個完整失調研究對象和 9 個部分失調研究對象，共 272 個失調樣本，佔全部樣本的 17.1%。且失調持續的時間與發生失調的次數具有指數關係

根據失調的定義，失調時期在全部測量量中都導致了很大一部分差異（圖1f）。這表明，隨著時間的發展，在某些極端病人中，活躍的疾病狀態和不活躍的疾病狀態之間差異會越來越大。

與之前橫斷面研究一致，CD 的失調與不失調樣本之間的差異比 UC 個體間更明顯。

同時，失調與不失調在一些宿主的測量值有顯著差異，例如血清中的 ASCA （抗釀酒酵母抗體），ANCA （抗中性粒細胞胞質抗體），OmpC （外膜蛋白C）和 CBir1 （抗鞭毛蛋白）。

同時，失調導致多樣性降低。

圖2. A）十種橫斷面分析中顯著差異的代謝物含量在對照、UC、CD 組裡的分佈情況；B）CD 和UC 中評估疾病活躍度的指標之間的關係；微生物失調分數（microbial dysbiosis scores）的分佈C）Bray–Curtis 相似性的中值D）與鈣衛蛋白的關係E）持續時間（左）和間隔時間（右）在 UC 和 CD 中的 Kaplan–Meier 曲線；

在物種

• CD 中的專性厭氧菌降低，以及大腸桿菌等兼性厭氧菌的富集。
• Ruminococcus torques 和 Ruminococcus gnavus 是 IBD 中的兩個富集的物種，在失調的 CD 和 UC 中也分別顯著差異。

在代謝組中：

• SCFAs 通常在失調組中減少（圖2f），特別是丁酸鹽的減少與之前觀察到的生產丁酸鹽的菌的消耗是一致的，例如 F. prausnitzii 和 R. hominis（圖2f）。
• 還檢測到初級膽汁酸膽酸鹽及其甘氨酸和牛磺酸結合物的富集，而次生膽汁酸石膽酸鹽和脫氧膽酸鹽在失調中減少，表明產生二級膽汁酸的細菌在 IBD 相關的生態失調中被耗盡，或者通過結腸的通過時間太短，這些化合物不能代謝。

微生物生態失調期間的這些顯著的代謝組學差異與疾病期間預期的變化一致，提供了進一步的證據證明失調狀態與 IBD 特別相關。

在生物化學上也發現了與失調相關的顯著差異。以及一個表型尚不清楚的噬菌體與失調狀態顯著相關。

圖2. F）顯著差異的宏基因組物種、代謝物、轉錄產物在失調和非失調樣本之間的差異

2.腸道微生態的穩定性降低

通過對時序宏基因組，宏轉錄組學和代謝組學數據的分析，每個受試者的微生物組傾向於隨時間偏離基線（圖3a）。對於 CD 和 UC 患者，在宏基因組數據的物種層面最為明顯。宏轉錄組中的物種結果也有同樣的趨勢。而 KEGG 的註釋結果、代謝組和蛋白組變化得要快很多，在最初兩週內迅速變化後，與最後一個時間點情況相差很小。表明這些特徵在腸道內迅速變化，且在發展過程中沒有額外的劇烈變化。

圖3. A）基於宏基因組物種丰度的時間點之間的Bray–Curtis 相似性結果

文章進一步想從連續時間點之間的移位（shifts）來確定腸道微生態長時間的變化。

移位的定義是在連續時間點變化中，人與人之間的 Bray–Curtis 相似性大於個人不同時間點的相似性。

在宏基因組分類學特徵的結果中，找到了 166 這種移位（39 來自對照組，44 來自 UC，83 個來自 CD）。考慮到對照和患者不同的採樣率，IBD 患者的移位發生率僅僅略高於對照組。

但是，相對丰度變化最大的物種在對照和 IBD 患者間顯著差異（圖3b）。

對照組中的移位主要發生在 Prevotella copri 中，在整個週期中丰度反覆升高與降低（圖3c）。在 IBD 患者中丰度不低且較為穩定。

圖3. B）在移位中變化最大的 10 個物種在不同組別中的移位頻率；C）P. copri 的相對丰度在三個組別中隨時間

同一方法應用於代謝組時，得到移位的發生率為宏基因組的一半。使用PERMANOVA 檢驗得到的相鄰時間點的代謝組差異，這些差異大部分都是由未知化合物驅動的。其他的包括尿膽素（urobilin，主要在對照組中），尿酸鹽（CD 組中）（圖3d,e）。

圖3. D）三組別的PCoA結果，以及對應的三種代謝物分佈情況；E）尿酸鹽含量在三個組別中隨時間的變化；

3.與微生態相關的宿主因素

將活檢組織的分子測量結果（RNA-seq、甲基化等）納入 IBD 微生物組分析後，發現影響分子測量結果的主要因素與影響微生物組的主要因素顯著不同。影響腸上皮組織基因表達的主要因素是取樣部位。因此，文章對每個活檢取樣部位進行了單獨的微生物組和關聯分析。

與對照樣本比較，從發炎位置為迴腸和直腸的樣本中分別鑑定出了 305 個和 920 個差異表達基因（DEGs）。

這些基因中包括可直接影響共生微生物的基因，如 CXCL6（細胞膜破壞因子）和SAA2 （抑制革蘭氏陰性菌的生長），以及間接影響微生物的 DUOX2（產生活性氧）和 LCN2 （通過隔離誘導微生物鐵缺失）（圖4b）。

對 DEGs 的 KEGG 註釋結果進行通路富集，其中免疫相關通路的結果很明顯。特別是 IL-17 信號通路在迴腸和直腸中富含上調的 DEGs（圖4a），其組成部分先前被發現存在於 CD 患者的迴腸活檢樣本的基因表達譜中。在來自 UC 患者的直腸活檢中上調的 DEGs 中，發現補體級聯（complement cascade）的富集，這是先天免疫的一個組成部分，與 IBD 有關。

進一步，對活檢組織進行了 16s 分析，確定哪些物種與這些 DEGs 相關。分別在迴腸和直腸中鑑定出了與上述基因相關的 31 個和 106 個沒有重複的 OTU。涉及基因包括已知的 IBD 相關宿主 - 微生物相互作用因子，

包括 DUOX2 及其成熟因子 DUOXA2，兩者都與迴腸中的 Ruminococcaceae UCG 005（OTU 89）的丰度呈負相關。

幾種被報道有抗菌作用的趨化基因（CXCL6，CCL20），與迴腸中 Eubacterium（OTU 120）和直腸的鏈球菌 Streptococcus（OTU 37）和 Eikenella（OTU 39）的相對丰度呈負相關。

最後，參與試驗的人群並不是為遺傳關聯分析設計的，但其中 92 個受試者都進行了外顯子測序，未來可以與其他群體進行整合分析。

4.多組學間的動態相互作用

利用下列十種測量數據構建關聯網絡搜索 IBD 相關的因子間的相互作用：宏基因組種水平結果，種水平轉錄率，EC 基因家族水平的功能丰度（MGX，MTX和MPX），代謝組，宿主轉錄組（迴腸和直腸），血清學和糞便鈣衛蛋白含量。

首先，使用相同的混合效應模型（或適當時的線性模型）對每種測量類型計算殘差，以確定差異丰度。得到的殘差用來最小化個體間的差異，因而凸顯跨時間的人群內的相互作用。

最終得到的網絡含有 53,161 個有效邊，2,916 個節點，並篩選出每個測量量中至少一端節點與失調相關的 p 值最小的 300 個邊進行可視化（圖4c）。

來自糞便的 5 個測量量的代表在網絡中被作為分線器（hubs,定義為至少有 20 個邊相連的節點），且都與失調相關。

其中與分類學相關的有 F. prausnitzii 和 Subdoligranulum 的未被分類的一支。F. prausnitzii 與在失調中下調的許多 EC 的表達顯著關聯。

而大腸桿菌則與在失調中上調的許多 EC 的表達顯著關聯。

Acylcarnitines（酰基肉鹼）和膽汁酸作為生物化學上的大分類在網絡中也出於突出地位，屬於這兩分類的部分化學物質在失調期間變化。

另外還有例如 SCFA 丙酸鹽、抗 OmpC 的抗體等生化指標以及三個宿主上的基因的迴腸表達量在網絡中出於突出位置。

圖4. A）在迴腸和直腸樣本中，人的差異表達基因，以及與表型和免疫通路的對應關係；B）宿主-微生物交互作用

M菌 · 筆記

本研究作為作為 HMP2 的一部分，研究涉及的數據和方法都可以在 IBDMDB 中獲取（https://ibdmdb.org/）

研究者依據 IBD 症狀活躍程度再將每個亞型（UC 和 CD）細分成 2 個亞組（一組是不太活躍的 IBD （症狀緩解或者最近才發生），另一組更為活躍 IBD，失調組）

本研究的一些新發現：

• 在疾病期間由梭菌引起的更大的基因表達；
• IBD 的個體中相對豐富的 P. copri 意外具有穩定性；
• 除了短鏈脂肪酸和膽汁酸之外，大量的酰基肉鹼失調有可能成為治療 IBD 的新靶點。

有待研究的問題：

• 代謝物的改變是由宿主還是微生物組驅動的；
• 尚未確定找到這些生物特徵是否能在疾病發生之前預測疾病事件；
• IBD 疾病時間軸變化有待深入探討。

參考文獻

Lloyd-Price J, Arze C, Ananthakrishnan A N, et al. Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases[J]. Nature, 2019, 569(7758): 655.

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