摘要：CRISPR/Cas基因編輯技術在植物基因功能研究和作物遺傳改良方面具有重要應用價值，其主要依賴gRNA引導核酸內切酶在目標基因組位置產生雙鏈斷裂（DSBs），DSBs在通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）方式進行修復時，會引起靶標位置核苷酸序列的缺失、插入或者替換，從而實現基因編輯。介紹了CRISPR/Cas基因編輯技術的作用機理及發展趨勢，並對CRISPR/Cas技術在主要糧食及經濟作物育種中的應用進展進行了總結，以期為農作物育種提供有益的參考。
培育高產優質且抗逆性強的農作物品種一直是育種家追求的育種目標，而傳統育種方法具有育種週期長、選育針對性差等缺點，難以實現快速育種的目標。CRISPR/Cas核酸酶技術是近年來發展起來的對基因組進行精準定點編輯的技術，具有操作簡單、週期短、效率高等優點，利用該技術可以對基因組中的目的基因進行定向敲除、插入或定點突變，從而精確引入目標性狀，為作物育種工作提供新的途徑。
1、CRISPR/Cas基因編輯技術簡介及發展
CRISPR/Cas基因編輯技術（genome editing）是植物基因功能研究和育種改良的熱點技術，其由小分子RNA介導，且主要依賴於核酸內切酶在目標位置產生雙鏈斷裂（double strand breaks, DSBs），DSBs可以通過非同源末端連接（NHEJ）和同源重組（HDR）兩種方式進行修復，通過NHEJ的修復容易發生錯誤，使斷裂位置產生小片段的缺失或插入，從而導致基因突變；在有供體DNA存在的情況下，有可能通過HDR進行斷裂位置的修復，產生精準的基因插入或替換。
CRISPR-Cas系統包括Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型三種類型，其中Ⅰ型和Ⅲ型需要多種蛋白參與才能形成具有功能的Cas蛋白複合體，而來自於化膿鏈球菌（Streptococcus pyogenes）的Ⅱ型系統僅需要一種Cas蛋白就能夠發揮作用。在Ⅱ型CRISPR-Cas系統中，入侵的外源核酸序列整合到前導序列與第一段重複序列之間，並轉錄成長鏈的CRISPR RNAs（crRNA）前體物，與反式激活tracrRNA（trans-activating crRNA）互補結合，然後在Cas9/RNAseⅢ加工下形成成熟的tracrRNA: crRNA複合物，通過crRNA與入侵DNA上原間隔序列互補配對，從而激活並誘導Cas9蛋白到原間隔序列的區域進行剪切，該過程需要在靶標DNA上有一段保守的PAM（protospacer adjacent motif）序列。Cas9蛋白包括兩個區域，其中HNH結構域切割與crRNA互補的DNA鏈，RuvC-like域則剪切非互補的DNA鏈，從而形成DSBs，降解入侵片段。科學家利用上述原理，通過將crRNA和tracrRNA序列相連構成一個嵌合的sgRNA（small guide RNA）分子，實現對靶標的識別，並利用Cas蛋白進行定點剪切形成DSBs，隨後通過體內NHEJ或HDR方式進行修復。近來，新一代CRISPR基因編輯工具CRISPR/Cpf1、單鹼基突變及無外源DNA汙染編輯的出現，標誌著CRISPR基因編輯技術又取得了突破性進展。
1.1新一代CRISPR基因編輯工具CRISPR/Cpf1
2015年，張鋒團隊首先發現了Ⅱ類CRISPR系統第5亞家族的成員Cpf1核酸內切酶，並證實了來自氨基酸球菌屬（Acidaminococcus）、弗朗西斯氏菌屬（Franisella novicida）和毛螺科菌屬（Lachnospiraceae）的AsCpf1、LbCpf1和FnCpf1都具有RNA引導的DNA內切酶活性，且AsCpf1和LbCpf1用於動物的基因組編輯效率與CRISPR/Cas9系統相似，但其與Cas9相比卻具有更多優勢：①Cpf1蛋白因更小而更容易進入組織和細胞；②Cpf1同時具有DNA和RNA內切酶活性；③Cpf1的初級轉錄產物pre-crRNA由Cpf1自身加工，不需要tracrRNA的參與；④Cpf1識別位於靶序列5′端富含胸腺嘧啶（T）的PAM序列，擴大了基因組編輯的靶點範圍；⑤Cpf1的切割位點離PAM序列較遠，便於對同一位點進行多輪基因編輯；⑥Cpf1剪切後形成黏性末端，讓DNA插入更可控。目前CRISPR/Cpf1基因編輯系統已被用於水稻、擬南芥等物種的基因組編輯，朱健康團隊\\[4\\]利用該技術對水稻中RLK和CYP81A家族的4個基因進行同時編輯，各位點的敲除效率達到40%~75%。近期，中國農業科學院作物科學研究所夏蘭琴團隊與華中農業大學趙雲德團隊合作，利用能夠識別“TYCV”序列的LbCpf1(RR)和LbCpf1(RVR)變體，以水稻OsPDS和OsSBEIIb基因為靶標基因，LbCpf1(RR)編輯效率達51%左右，該研究擴展了CRISPR/Cpf1系統在植物基因組中的編輯範圍。
在農作物遺傳改良方面，少部分可以通過完全破壞基因功能來獲得育種材料，但更多的是需要置換單個或數個鹼基來改變基因的功能，從而實現定向改良作物農藝性狀的目的，而利用CRISPR/Cas9定點修飾主要是依賴於效率低下的同源重組機制。2016年，哈佛大學David Liu團隊發現了一種新的基因編輯工具——單鹼基編輯系統。單鹼基編輯技術通過將Cas9切口酶(Cas9 nikase, Cas9n)或無核酸酶活性的Cas9（nuclease dead Cas9, dCas9）與胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）形成融合蛋白，並通過sgRNA（單鏈嚮導RNA）將融合蛋白引導至靶位點，在不引起DNA雙鏈斷裂的情況下對靶位點附近的單個鹼基進行由C/G到T/A的精確置換，目前該技術已在植物、動物以及人細胞中實現了高效的定點突變。朱健康團隊利用單鹼基編輯系統APOBEC1-XTEN-Cas9（D10A），率先實現了對水稻氮轉運蛋白家族NRT1.1B和DELLA家族SLR1的鹼基替換，隨後高彩霞團隊通過改進，成功地將此係統運用到三大重要農作物小麥、水稻和玉米的性狀改良上，為作物品種改良帶來了新的途徑。
目前常用的CRISPR/Cas9基因編輯技術主要是通過基因槍或農桿菌侵染的方法將DNA表達框整合到植物基因組中，此種方法一般需通過後代分離才能獲得無CRISPR/Cas9 DNA的突變體材料。DNA\\|free基因組編輯技術的建立，大大降低了外源DNA的整合率，為CRISPR/Cas9技術用於農作物品種改良提供了新思路。DNA\\|free基因組編輯是通過將CRISPR/Cas9蛋白與gRNA在體外組裝成核糖蛋白體（RNP），實現無外源DNA的基因編輯體系，避免外源DNA整合到基因組中產生潛在風險，從而推動作物基因編輯育種的發展。此技術已經在擬南芥、菸草、生菜等模式植物和水稻、玉米、小麥等主要糧食作物中得到了成功應用。高彩霞團隊以小麥為研究對象，對此方法步驟做了詳細總結，為其廣泛應用提供了有力的技術支持。最近，瑞典科學家利用RNP方法成功實現了馬鈴薯的DNA-free基因組編輯，編輯效率達9%~25%。
2、CRISPR-Cas技術在作物育種中的應用
自CRISPR/Cas9技術被用於進行基因定點編輯以來，被廣泛應用於酵母、果蠅、斑馬魚、小鼠、人類等多個物種中。2013年8月，《Nature Biotechnology》期刊上同時刊登了3篇關於CRSPR-Cas9技術介導植物基因組定點編輯的文章，預示著該技術在植物中的廣泛應用和迅速發展。其中Nekrasov等利用CRISPR-Cas技術在本生煙（Nicotiana benthamiana）中實現了基因組的定點突變，突變效率約為2%；Li等利用CRSPR-Cas9分別對擬南芥和本生煙中的PDS基因進行定點編輯，在原生質體系統中，擬南芥AtPDS和本生煙NbPDS突變效率分別為5.6%和38%，而通過農桿菌浸染髮現，在植物中AtPDS和NbPDS的突變效率相差不大（擬南芥為2.7%，本生煙為4.8%），表明突變效率與植物基因型、生理狀態和轉化方式密切相關。該研究還在原生質體中成功實現了對AtPDS3的兩個不同位點和同時對兩個基因（AtRACK1b和AtRACK1c）的編輯，為植物基因編輯打開了新的思路；高彩霞團隊利用基因槍技術首次在水稻中對OsPDS和OsBADH2基因進行敲除，突變效率分別為9.4%和7.1%，並獲得了T0代PDS基因敲除的水稻純合突變植株。同時，朱健康團隊也利用CRISPR-Cas9技術分別在擬南芥和水稻中進行基因定點突變，突變效率分別為26%和84%；瞿禮嘉團隊通過對Cas9蛋白進行優化，使該系統在水稻中對OsCAO1和OsLAZY1基因的編輯效率分別高達83%和92%。CRISPR/Cas9技術在植物中，尤其是作物中的成功應用，為該技術在作物品種改良中的應用提供了有力的技術支持，隨後大量相關研究相繼開展。
2.1在糧食作物育種中的應用
水稻是世界上最為重要的糧食作物之一，並且水稻遺傳轉化更易操作，因此近年來利用CRISPR/Cas9技術開展與水稻產量、品質及抗性相關的研究被大量報道。產量方面，王加峰等利用CRISPR/Cas9技術對調控水稻產量千粒重的基因TGW6定點編輯，T0代材料中該基因突變頻率約為90%，其中純合缺失突變率高達51%，T1代純合缺失突變體千粒重顯著增加。Li等利用CRISPR/Cas9技術以中花11作為轉化材料對Gn1a、DEP1、GS3及IPA1基因進行定點敲除，結果表明T0代材料中突變效率分別為42.5%、67.5%、57.5%、27.5%，T2代純合缺失突變體中植株籽粒數目及長度增加，達到增產的效果；品質方面，中國水稻研究所和東北地理與農業生態研究所同時採用CRISPR/Cas9技術對控制水稻香味的BADH2基因進行敲除，結果表明突變體材料中香味物質顯著增加，為香稻育種提供了豐富的理論指導，加快了香稻的育種進程。抗性方面，李家洋與高彩霞團隊利用CRISPR/Cas9技術以NHEJ修復方式對水稻5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶基因（EPSPS）進行編輯，實現了水稻內源EPSPS基因保守區域兩個重要氨基酸的定點置換，在T0代獲得具有草甘膦抗性的突變體材料。Wang等利用CRISPR/Cas9技術修飾稻瘟病侵染效應因子基因OSERF922，以提高水稻對稻瘟病的抗性。近期，Tang等與袁隆平團隊利用CRISPR/Cas9技術敲除水稻中與鎘離子吸收和積累相關的基因，獲得了抗鎘毒害的水稻品種。此外，朱健康研究組利用新型腺嘌呤鹼基編輯器ABE7-10對調節水稻株型的OsSPL14和SLR1進行單鹼基編輯，A/T到G/C的替換效率分別為26%和12.5%，該研究推動了作物精準分子育種的發展。
玉米不僅是世界第一大糧食作物之一，也是飼料、化工和醫用等的原料。朱金潔等經過摸索，搭建了玉米基因組高效定點突變的技術平臺，並在玉米全基因組範圍內篩選高度特異的sgRNA靶標序列，為玉米品種改良提供了強有力的技術支持。杜邦先鋒公司利用CRISPR-Cas9技術，將自然存在的糯玉米性狀直接引入具有優良性狀的雜交種中，解決了糯玉米產量低的問題，同時避免了繁雜的回交育種工作，同年，該公司利用CRISPR-Cas9技術將一個玉米內源啟動子GOS2精確插入到玉米中乙烯應答調控因子ARGOS8的5′端，獲得耐旱材料。
小麥屬於異源多倍體，基因組龐大，因此通過傳統方法育種難度很大。Zhang等利用CRISPR/Cas9系統對小麥粒長和粒重調控基因TaGASR7和穗密度調控基因TaDEP1進行定點編輯，獲得的TaGASR7純合突變材料粒重顯著增加，TaDEP1純合突變材料明顯變矮。高彩霞和唐定中團隊利用CRISPR/Cas9技術，獲得了同時敲除3個同源基因的突變體，該突變體對白粉病表現出有較強抗性。
2.2在經濟作物育種中的應用
Cai等利用CRISPR/Cas9技術對大豆光週期開花途徑關鍵基因GmFT2a進行了定向編輯，靶向大豆內源GmFT2a上的3個位點，T1代純合突變體植株花期延遲。Wang等建立了適用於棉花遺傳轉化體系的CRISPR-Cas9系統，以棉花葉綠素合成相關基因GhCLA1為靶標設計3對sgRNA，各靶標位點的編輯效率高達到66.7%~100%，為推動棉花基因組編輯工作打下了堅實基礎。Xu等利用CRISPR-Cas9技術對CLV3進行了基因編輯，使得番茄果實的心室數顯著增加；Soyk等採用CRISPR/Cas9技術對番茄抗成花基因SP5G進行定向編輯，突變體材料番茄開花及成熟時間提前約2周，且產量顯著增加。以上研究結果表明該技術在番茄重要農藝性狀改良方面具有巨大的應用潛力。雙孢菇(Agaricusbisporus)非常容易褐變，從而影響其品質。Waltz利用CRISPR/Cas9技術對雙孢菇的1個多酚氧化酶基因PPO進行定向編輯，獲得的突變體材料中多酚氧化酶的活性降低了30%，抗褐變能力大幅提高。
3、展望
傳統育種需要投入大量的時間和精力，才能將相關基因的有益變異累積為最佳的品種，而通過CRISPR/Cas9技術能夠直接且有目的進行優良性狀選擇。但CRISPR/Cas9系統目前還存在一些技術方面的問題，有待進一步改進和探討：①以往報道的CRISPR/Cas9技術在應用過程中會出現一定程度的脫靶現象，引起基因組非靶向位點的突變，這樣會造成研究結果的不確定性，嚴重限制了該技術的應用。提高sgRNA序列特異性和使用合適的Cas蛋白等都能夠有效降低甚至消除脫靶現象。此外，2017年Rauch等在細菌中發現了能夠阻斷CRISPR-Cas9活性的AcrllA4蛋白，該蛋白讓CRISPR-Cas9在基因編輯一段時間後“關閉其活性”，防止在不必要的位點隨意剪切造成的脫靶效應。在此基礎上，Yang和Patel採用冷凍電子顯微鏡和人體細胞培養等方法進一步揭示了AcrIIA4主要是通過競爭Cas9蛋白上的DNA結合域發揮作用，這一發現為CRISPR/Cas9技術在育種中的廣泛應用提供了強有力的支持和保障。②基因編輯範圍有限。CRISPR系統中，DNA的精確剪切依賴於gRNA及PAM序列。目前的研究中，CRISPR/Cas9所識別的PAM位點包括經典的“NGG”和Cas9改變後的“NGA”和“NGCG”等。CRISPR/Cpf1系統的發現進一步拓寬了基因組編輯的範圍，與CRISPR/Cas9不同，CRISPR/Cpf1的PAM序列主要位於“T/A”富集區，包括LbCpf1識別的“TTTV”及LbCpf1(RR)變體識別的“TYCV”。如何有效拓展CRISPR系統PAM位點範圍，是該技術在育種中廣泛應用的關鍵所在。③提高同源重組（HDR）效率。目前CRISPR技術在作物育種中的應用，主要集中於依賴HNEJ途徑的基因敲除，如何通過HDR實現高效率的大片段插入或鹼基替換仍是一個挑戰。Charpentier等最近的研究中，通過將同源重組過程早期關鍵蛋白CtIP與Cas9蛋白融合，從而激活HDR途徑，在人類細胞、鼠受精卵細胞中將編輯效率提高2倍以上。Aird等將供體DNA通過PCV共價鍵連接到Cas9/gRNA核糖核蛋白複合體上，增加DSB處供體DNA的濃度，從而提高Cas9介導的同源重組修復效率。利用HDR在靶位點插入目的基因，將是基因編輯育種的重要攻關內容之一。
總之，雖然目前基因編輯技術還存在很多不足，但其相對傳統育種的優勢顯而易見，因此其具有廣闊的發展和應用前景，相信在不久的將來，經過優化和改良的基因編輯技術將成為培育作物新品種的主要手段之一。
作者單位：中國農業科學院生物技術研究所
文章來源：《生物技術進展》2018年第8卷第3期
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