一九三七年十一月三日，國共雙方認可的北伐名將、新四軍軍長葉挺受邀抵達延安，受到隆重的歡迎。
毛澤東會見了葉挺，解釋了中國共產黨在對日作戰中的路線、方針和政策，並一起研究了改編南方紅軍游擊隊的諸項事宜。葉挺返回武漢後，經與國民政府軍事委員會反覆磋商，終於達成協議，規定：新四軍獨立建制，不隸屬八路軍，歸戰區統轄；軍以下不設師和旅，轄支隊和團，部隊全部開赴抗日戰場。
同時，新四軍堅持共產黨的領導和敵後游擊戰的獨立性原則，國民黨不派人進入新四軍。
一九三八年一月六日，新四軍軍部遷往南昌三眼井，正式宣佈成立。葉挺任軍長，項英任副軍長，張雲逸任參謀長，周子昆任副參謀長，袁國平任政治部主任，鄧子恢任副主任。全軍共轄四個支隊：
第一支隊，司令員陳毅，副司令員傅秋濤，所轄一團團長傅秋濤兼任，二團團長張正坤；
第二支隊司令員張鼎丞，副司令員粟裕，所轄三團團長黃火青，四團團長盧勝；
第三支隊司令員張雲逸兼任，副司令員譚震林，所轄五團團長饒守坤，六團團長葉飛；
第四支隊司令員高敬亭，副司令員周駿鳴，所轄七團團長楊克志，八團團長周駿鳴兼任，九團團長顧士多，手槍團團長詹化雨。
軍部轄直屬特務營。
全軍總計一萬零三百人。
一九三八年春，新四軍首先在安徽舒城打響了阻擊日軍的戰鬥。
之後，在巢縣東南的蔣家河口伏擊了日軍的守備船隊，又在南京至句容間伏擊了日軍南進的汽車隊，在鎮江西南的韋崗附近伏擊了日軍的另一支汽車隊，同時夜襲南京以南西善橋的敵人守備隊，破壞了南京至鎮江間的鐵路，致使交通“阻斷三日”。
由於日軍兵不敷出，只能沿交通線駐紮於重要的城鎮和車站，於是新四軍控制了寧滬鐵路沿線的大部分村莊。
新四軍與日軍“每日必有接觸。據稱在此六個月中間，新四軍所殺傷之日軍，達二千五百之多，並奪獲日軍步槍五百餘支”。
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