多數癌症可被免疫系統識別並攻擊，但是因為腫瘤介導的免疫抑制和免疫逃逸機制而進展不一。輸注體外工程化T細胞，即T細胞過繼療法(adoptedT cell therapy)，能增加患者的天然抗腫瘤免疫反應。基因療法重定向免疫特異性與基因編輯相結合具有改善療效並增加工程化T細胞安全性的潛力。CRISPR與Cas9(CRISPR相關蛋白9)偶聯核酸內切酶是一項強有力的基因編輯技術，具有靶向T細胞中多個基因來改善腫瘤免疫療法的能力。
工程化T細胞療法給癌症治療帶來了革命性的變化，在血液相關癌症，如白血病和淋巴瘤的治療過程中獲得了長期持續的緩解。該療法涉及取出患者T細胞，“重新編輯”使其攻擊癌細胞，然後再將它們轉移回患者。使用CRISPR-Cas9的靶基因滅活(敲除)能增強T細胞活性，並且有擴增細胞療法應用的潛力。然而直到現在，仍然不知CRISPR-Cas9編輯T細胞在回輸人體後能否耐受並增殖。Stadtmauer等人發表了I期臨床試驗(NCT03399448)晚期難治性癌症患者接受CRISPR-Cas9修飾T細胞治療的數據，他們將這種細胞稱為CRISPR-Cas9 NYCE T細胞。結果顯示了基因編輯的治療性應用的一項重要進展，並突出了加速開發細胞療法的潛力。
圖表1. CRISPR-Cas9 NYCE T 細胞示意
來源：《Science》，中康產業投資研究中心
工程化細胞療法的生產涉及用脫毒病毒轉導分離出的患者T細胞，使其通過表達嵌合抗原受體(chimeric antigen receptors,CARs)識別呈現在癌細胞表面的抗原，或者通過表達T細胞受體(Tcell receptors, TCRs)識別癌細胞內的癌症相關多肽抗原。轉導後，工程化T細胞數量被擴增，然後回輸病人體內。雖然對治療一些類型的癌症高度有效，工程化T細胞活性的特異性和壽命可被改善。例如，T細胞活性通過PD-1(程序性細胞死亡蛋白1)受體被天然下調。系統性抑制患者的PD-1能增強T細胞活性，但經常誘發不良自體免疫反應。此外，內源性的TCR表達與工程化T細胞的轉基因受體競爭，干擾信號傳遞或細胞轉運。敲除TCR基因和編碼PD-1的PDCD1基因在臨床前人腫瘤異種移植小鼠模型中能增強工程化人體T細胞活性。上文提到，Stadtmauer等測試了CRISPR-Cas9敲除這些基因的患者衍生T細胞在回輸人體後是否安全和持久。
來源：《Science》，中康產業投資研究中心
一項試驗入組了六名骨髓瘤或肉瘤患者，其中三名滿足T細胞回輸的研究標準。通過兩步處理來獲得原生TCR和PDCD1基因敲除，以及在工程化細胞中轉基因TCR的表達。在第一步，分離出的患者T細胞用預成型的Cas9蛋白的核糖核蛋白(RNP)電穿孔，並引導RNA靶向內源性TCR-TCRα(TRAC)、TCRβ(TRBC)及PDCD1，進行基因中斷。在第二步，細胞用病毒載體轉導以表達轉基因TCR，其能識別癌症-睪丸抗原(NY-ESO-1)，並且在培養基中擴增以產生NY-ESO-1轉導CRISPR 3X編輯細胞(NYCE)細胞。值得一提的是，NYCE細胞消除了表達NY-ESO-1的細胞，比單獨表達NY-ESO-1 TCR的T細胞更加有效，符合成功敲除內源性TCR的預期結果。
圖表3. 患者統計資料
來源：《Science》,中康產業投資研究中心(*定量聚合鏈反應(qPCR)，**免疫組織化學)
NYCE細胞成功植入全部患者，並且在回輸9個月之後仍可被檢測到。未經CRISPR基因編輯的、表達NY-ESO-1 TCR的T細胞在此前的臨床試驗中輸注後的半衰期約為1周。從一名研究參加者重新分離出的NYCE細胞的基因表達特徵與中央記憶細胞一致，標誌著穩定的移植。此結果與之前的研究形成鮮明對比，表達NY-ESO-1 TCRs的未編輯細胞展示出T細胞耗竭的標記物。CRISPR-Cas9對內源性TCR和PD-1的中斷改善了工程化T細胞的細胞殺傷能力並且促進了長期的持續性。
CRISPR-Cas9編輯細胞的人體安全性是必須考慮的重要問題。目前不清楚Cas9編輯的細胞是否將有免疫原性，也不清楚殘留的細菌蛋白Cas9是否將會誘發免疫反應。Stadtmauer等報道在三名患者中未觀察到NYCE細胞的編輯相關毒性。此外，雖然研究參與者有預先存在的T細胞和Cas9蛋白的特異性抗體，抗體滴定在整個研究過程中未從基線增加。Cas9免疫反應缺失可能歸因於接受NYCE細胞患者的免疫抑制，或者是因為Cas9作為一個非病毒、預先形成的RNP遞送。與病毒遞送導致被治療細胞持續表達Cas9相比，RNP在細胞中的半衰期有限。Stadtmauer等也報道了CRISPR-Cas9的最小脫靶編輯，不超過1%的NYCE細胞在回輸後含有染色體易位減少。這些發現為安全生產和無免疫性給予基因編輯體細胞提供了指南。
現存尚未解答的最大問題是CRISPR編輯的工程化T細胞對於晚期癌症是否有效。關於NYCE細胞的I期試驗評估了安全性，但治療患者的療效並未評估。在研究末期，一名參與者因癌症進展死亡，另外兩名患者接受了其他療法。雖然Cas9工程化細胞的療效因此而模糊，此研究受到2016年出臺的編輯方案限制。此研究的基因中斷效率一般(15到45%)，然而現存的方案使用Cas9RNPs在人T細胞中獲得超過90%的基因中斷。此外，近期工作已證實CAR轉基因插入人T細胞TRAC基因，同時導致內源性TCR的敲除，同時通過原生啟動子驅動CAR的表達。在產生精準基因修飾及其他癌症相關靶點選擇方面的進步，可增強工程化T細胞治療其他癌症的療效，包括實體瘤，大部分對工程化細胞療法的活性具有抗性。
臨床證實的CRISPR基因編輯細胞的長期安全性為下一代基於細胞的療法鋪平了道路。雖然其他類型基因編輯體細胞(如干細胞)的安全性仍然待定，但是振奮人心的消息是首批輸注CRISPR-Cas9修飾細胞的β地中海貧血和鐮狀細胞貧血患者顯示出健康的血液產生。隨著更多的基因標記療法被證明安全且有效，臨床轉化的障礙將成為細胞製造和給藥。工程化細胞的生產工藝和修飾體內靶細胞的CRISPR-Cas9遞送策略亟待重構以減少成本，使這些革命性的療法惠及能夠獲益的患者。
閱讀更多 新康界 的文章
