在基因组研究高速发展的今天，染色体的着丝粒部分仍然是一个颇具神秘色彩的“黑盒子”。高度凝聚的异染色质结构和大量的串联重复序列，是着丝粒在细胞分裂过程中执行使命的必备手段。但这样的特征不利于基因组片段的分离获取和比对识别，给基于高通量测序的研究技术带来了不少困难。
俗话说得好：“世上无难事，只怕有心人”。生命科学领域的新颖研究方法层出不穷，配合不断更新的测序技术和生信工具，我们对于着丝粒的了解也日益增加。Hi-C作为破解染色质互作关系和空间构造的“终极武器”，不仅可以识别异染色质的分布区域，还能评估异染色质的凝聚程度，在着丝粒相关研究中也大有用武之地。
2019年发表于Molecular Cell（IF=14.548）的一篇论文[1]中，复旦大学文波教授研究组正是利用Hi-C在内的多种技术手段，对着丝粒周边异染色质的维持机制进行了剖析。安诺基因为本研究提供Hi-C和转录组测序服务，为挖掘重编程机制的征途提供助力！带着对“黑盒子”着丝粒满满的好奇心，和小编一起来学习如何利用高通量测序技术，探索异染色质形成的奥秘吧~
主要研究结果
SAFB蛋白：染色质的“黏合剂”
着丝粒周边异染色质（pericentromeric heterochromatin，PCH）的形成是一个复杂的过程，具有多种元件参与其中。异染色质区域往往存在大量的H3K9me3组蛋白修饰，指导HP1α等reader蛋白执行功能；而调控组蛋白修饰的过程，涉及到主要卫星RNA（major satellite RNAs，MajSAT RNAs）对组蛋白甲基转移酶的定位。核基质（nuclear matrix，NM）中的一些蛋白具有RNA结合功能，可能在染色质结构维持方面具有作用。
基于以往对于核基质蛋白的了解，研究者推测其中的SAFB（scaffold attachment factor B）在染色质构成中具有重要意义。在小鼠AML12细胞中敲低Safb基因，免疫荧光成像显示标志异染色质的H3K9me3聚集的焦点区域变小；DNaseI消化实验显示染色质可接近性显著提高；DAPI染色的焦点变得弥散。这些现象表明SAFB表达量下降造成染色质凝聚程度下降。而在NIH 3T3细胞中进行SAFB-GFP过表达则导致了相反的染色质凝聚加强效果。这些证据表明，SAFB是染色质发生凝聚所必需的“黏合剂”，SAFB减少会导致染色质高级结构变得松散。
SAFB减少导致异染色质信号弥散（左），而过表达使信号进一步集中（右）
Safb敲低导致PCH的高级结构重塑
为了判断SAFB减少后着丝粒周边区域的构造是否变化，研究者比较了Safb敲低前后AML12细胞的Hi-C交互矩阵。结果显示，Safb敲低后染色体间着丝粒相邻区域的互作显著增加，接触频率明显上升。另一方面，尽管ChIP-seq和ChIP-qPCR都显示Safb敲低没有显著影响H3K9me3的修饰水平和分布区域，但HiChIP数据显示Safb敲低后H3K9me3修饰结构域内的互作减少，结构域间互作增加。这表明H3K9me3修饰的染色质结构域在Safb敲低后发生了重构。
SAFB缺失组与对照组的Hi-C矩阵变化（左）和SAFB缺失下的结构变化示意（右）
SAFB与MajSAT RNAs协作维系异染色质
前期研究已经发现SAFB可以与多种RNA发生结合，这可能是其发挥功能的关键。研究者利用RIP-seq鉴定了大量与SAFB相关的RNA，其中包括MajSAT RNA等来自异染色质重复元件的多种非编码RNA。MajSAT RNA在细胞核中与SAFB存在共定位，而敲低MajSAT RNA可以导致SAFB-GFP信号弥散化，同时引发与SAFB缺失相似的异染色质凝聚下降，这表明两者在维系异染色质的过程中“携手同心”，缺一不可。
MajSAT RNA敲低组（右）的SAFB-GFP信号较对照组（左）更为弥散
研究者在此基础上进一步对两者协作调控异染色质凝聚的机制进行了探究，并最终推断SAFB通过识别MajSAT RNA的结合motif形成了一种相分离（phase separation）模式，并由此组织了PCH的高级结构。SAFB缺失后这种相分离在着丝粒周边减弱，导致了H3K9me3和HP1α的解聚。
SAFB缺失影响三维基因组结构
理解了SAFB调控异染色质的“招式”，研究者进一步推测SAFB缺失可能会影响整个染色质的三维结构。基于AML12细胞的Hi-C数据，研究者发现Safb敲低后A/B compartments分布位置变化不大，但compartments内部和之间的互作发生了一定程度的改变，在SAFB缺失细胞中compartment scores都有显著下降。TAD分析显示，SAFB下降后TAD边界的强度普遍降低，表明TAD结构发生了整体的弱化，这与染色质的解聚一致。在B compartments中的TAD内互作降低更为明显，可能是因为B compartments的染色质缩聚程度更高，所受影响更大。
Safb敲低组与对照组部分交互矩阵及compartments、TAD等结果的展示
文章总结
这篇高分文章可谓是众多技术“群英荟萃”：通过免疫荧光成像来观察核内异染色质的变化情况，利用Hi-C实现变化区域定位和全基因组变化评估，RIP-seq成功筛选出与SAFB互作的MajSAT RNA，又借一系列实验证明两者主导的相分离是异染色质组织的背后机制。将直观的实验结果与精准的生信分析相结合，破解着丝粒“黑盒子”的复杂机制，其中“运斤如风”的娴熟手法颇具学习意义~
安诺基因作为业内三维基因组测序技术的引领者，自2015年初首次在国内推出动物群体Hi-C服务，随后将人类染色体三维构象解析分辨率提升至1kb水平，同年12月在国内首次推出植物Hi-C服务。5年来，安诺Hi-C技术不断发展，助力众多研究者取得丰硕的成果。作为服务提供方，安诺基因与法国居里研究所、中国农业大学、中科院动物所、复旦大学、西南大学、南京医科大学等多家科研院所深度合作，相关研究成果已发表在Nature、Cell、Molecular Plant、Nature Plants、Nature Communications、Molecular Cell 等国际高水平期刊，累计IF 175.3，平均IF 14.5。
参考文献：
[1] Huo X, Ji L, Zhang Y, et al. The Nuclear Matrix Protein SAFB Cooperates with Major Satellite RNAs to Stabilize Heterochromatin Architecture Partially through Phase Separation[J]. Mol Cell, 2020, 77(2): 368-383 e7.
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