單鹼基編輯技術（base editors，BEs），指能在基因組上引起單個鹼基改變的基因編輯技術，可在不形成 DNA 雙鏈斷裂的情況下對靶基因位點的單個鹼基進行胞嘧啶 C→胸腺嘧啶 T 或腺嘌呤A→鳥嘌呤G 的精準編輯。近年來由於單鹼基編輯技術的強大、高效，以及不會產生DNA雙鏈斷裂等特點，逐漸成為人們關注的熱點，有望在未來的基因治療中大顯身手。因此，利用單鹼基編輯技術治療β-血紅蛋白病（如地中海貧血）將是一個絕佳的基因治療策略。
β-地中海貧血(簡稱“β-地貧”)是一種常見的由於β-珠蛋白(β-globin)亞基突變導致成人血紅蛋白(Adult Hemoglobin，HbA，由β-globin和α-globin組成)異常的遺傳性疾病。異體造血幹細胞移植可根治“地貧”，但限制條件太多,並不能得到廣泛應用。臨床發現,疾病嚴重程度與胎兒血紅蛋白(Fetal Hemoglobin，HbF，由γ-globin和α-globin組成)的含量密切相關,部分病人體內HbF較多,則併發症較輕,死亡率也低，因此，增加病人體內HbF的含量是治療或緩解這類貧血的重要方法之一。γ-globin是一種胎兒時期表達的珠蛋白，該珠蛋白具有和β-globin相似的功能，編碼該蛋白的基因HBG在上述貧血患者中序列完好，但到成年期表達便會被沉默。因此，重新激活患者體內γ-globin基因的表達來彌補缺損的β-globin是近年來興起的一種治療策略。
先前研究發現，BCL11A基因在紅細胞中具有抑制γ-globin基因的表達的作用。這些研究提示，在患者造血幹細胞中靶向編輯BCL11A紅系增強子會重新激活HbF的表達，再將高效編輯後的造血幹細胞移植給患者重建造血，可產生高表達HbF的紅細胞，且不會影響淋巴細胞的分化、成熟
【1-3】。2020年3月16日，Nature Medicine雜誌發表題為“Therapeutic base editing of human hematopoietic stem cells”的研究論文，該研究證實通過新一代單鹼基編輯技術有望徹底根治由β-globin珠蛋白突變引發的系列遺傳疾病【4】。哈佛大學醫學院及波士頓兒童醫院Daniel Bauer教授實驗室的曾靜、華東師範大學吳宇軒研究員、波士頓兒童醫院任春妍為共同第一作者。
2019年3月，同一研究團隊曾在Nature Medicine雜誌發文，發現利用基因編輯技術靶向編輯BCL11A紅系增強子，會重新開啟γ珠蛋白表達，代替有缺陷的β珠蛋白（詳見BioArt報道：Nat Med | 有望徹底根治！吳宇軒博士等通過基因編輯治療β-地中海貧血和鐮刀狀貧血疾病）【5】。而此研究用單鹼基編輯系統代替了之前傳統的基於雙鏈斷裂的基因編輯系統，有望成為一個更為安全可靠的基因治療策略，同時為造血幹細胞中其他血液疾病致病位點的原位修復提供了可能。
圖1. 通過單鹼基編輯技術編輯β-地中海貧血患者造血幹細胞
首先，本研究通過優化編輯系統，實現了單鹼基編輯器在人CD34+造血幹/祖細胞中的高效基因編輯，然後通過編輯紅系特異增強子BCL11A +58位點造成BCL11A在紅細胞中表達下調。將編輯過後的CD34+細胞體外紅系分化後，發現BCL11A的表達水平顯著降低，同時HbF的含量得到極大提升。本研究還對-28型地中海貧血類型的患者來源CD34+細胞進行了編輯，同時嘗試了通過單鹼基編輯器同時改變HBB -28和BCL11A +58雙位點，結果發現分化後的紅細胞分化更加成熟、體積和形態都恢復至接近於健康細胞水平。
接著，研究人員證實了編輯後的幹細胞在移植至小鼠骨髓4個月後仍然保持著極高的編輯效率，且HSC更傾向於C>T編輯，同時能在體內激活紅細胞中胎兒血紅蛋白的表達。
圖2. 新一代單鹼基編輯工具編輯後的CD34+細胞中可以在小鼠骨髓中長期歸巢並保持高效率的C>T鹼基編輯
最後，研究人員證明了鐮刀狀貧血病人來源的CD34+細胞也能被高效編輯且在編輯後移植至小鼠體內重建人源血液系統，同時紅細胞中HbF的提升水平足以幫助細胞恢復正常形態，抵抗鐮刀化。這一研究證實了單鹼基編輯器在造血幹細胞的基因治療應用中的巨大潛力，同時為地中海貧血及鐮刀狀貧血的臨床治療提供了新的解決方案。
圖3.鐮刀狀貧血患者來源CD34+細胞經單鹼基編輯後產生的紅細胞可以抵抗鐮刀化
綜上，通過單鹼基編輯技術編輯β-地中海貧血和鐮刀狀貧血患者造血幹細胞中的BCL11A增強子位點，或者直接修復發生突變的HBB基因，並進行自體造血幹細胞移植，可以使其在體內分化產生具有正常功能血紅蛋白的紅細胞，從而有可能徹底根治此類疾病。
之前，同一研究團隊開發了基於CRISPR/Cas9基因編輯技術的治療策略，相關臨床實驗已經於2018年獲得FDA批准，由醫藥公司Vertex/CRISPR therapeutics主導，在美國和歐洲開展針對β-地中海貧血和鐮狀細胞病的I/II期臨床實驗。2019年底，前兩例病人的臨床數據被公佈，一例地貧病人及一例鐮貧病人在接受基因編輯後的造血幹細胞回輸後，貧血症狀得到治癒併成功脫離輸血。我國“地貧”基因攜帶者約3000萬人，涉及近3000萬家庭、一億人口，其中重型和中間型“地貧”患者約30萬人。而由於異體造血幹細胞配型困難和血庫資源不足，這些患者很多都不能得到有效治療。因此，此項研究及其臨床實驗的推廣有望為我國β-地中海貧血患者提供全新的基於自體幹細胞移植的臨床方案，造福廣大患者和社會。
圖4. 通過CRISPR/Cas9基因編輯技術激活胎兒血紅蛋白HbF，結合自體造血幹細胞移植治療血紅蛋白病示意圖(Lettre and Bauer. Lancet. 2016)
原文鏈接：
https://doi.org/10.1038/s41591-020-0790-y
參考文獻
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2. D.E. Bauer, S.C. Kamran, L. Samuel, X. Jian, F. Yuko, L. Carrie, S. Zhen, M.C. Canver, E.C. Smith, P. Luca, An Erythroid Enhancer of BCL11A Subject to Genetic Variation Determines Fetal Hemoglobin Level, Science, 342 (2013) 253-257.
3. Canver, M. C. et al. BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis. Nature 527, 192–197 (2015).
4. Zeng J, Wu Y, Ren C, Bauer DE, et al. Therapeutic base editing of human hematopoietic stem cells. Nature Medicine, 2020
5. Wu Y, Zeng J, Roscoe BP, Liu P, Yao Q, Lazzarrotto CR, Clement MK, Cole MA, Luk K, Baricordi C, Shen AH, Esrick EB, Manis JP, Dorfman DM, Williams DA, Biffi A, Brugnara C, Biasco L, Brendel C, Pinello L, Tsai SQ, Wolfe SA, Bauer DE, Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells. Nature Medicine, 2019
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