死亡時間（postmortem interval，PMI）推斷一直是法醫學研究的重點內容，其有助於正確判斷犯罪作案時間和及時布控偵查措施。有研究根據死後屍體變化如角膜混濁程度、屍僵形成與緩解情況、屍斑改變情況、屍溫與環境溫度等方面推斷PMI，但其受影響的因素眾多，PMI推斷的結果相對準確度不高。20世紀60年代，研究開始利用眼組織推斷PMI，發現隨著死亡時間的延長，眼角膜、視網膜、玻璃體液及房水等均出現規律性的變化，並與死亡時間高度相關，可用於死亡時間推斷。本文對其在法醫學領域的研究進展作以綜述。
1 眼角膜與PMI推斷
長期以來，角膜混濁程度一直應用於法醫學實踐中早期PMI推斷。個體死後角膜的形態學變化呈現一定的規律性，其混濁度在一定時間內會逐漸加重。通過肉眼觀察，再結合主觀經驗可大致推斷PMI。法醫工作者根據個體死後角膜的混濁度（Turbidity of cornea, TC）變化來大致推斷死亡時間，誤差在12h左右，較大程度受主觀印象影響[1]。
1.1 角膜清晰度與PMI的關係
存活狀態下，角膜清晰主要依靠角膜內皮細胞膜的主動水轉運功能和其與房水間的機械性屏障作用來維持。死後角膜內皮細胞會隨時間延長凋亡，主動性水轉運功能下降，機械性屏障作用消失，大量水分穿過角膜內皮層滲透到角膜基質層，造成角膜厚度逐漸增加而透明度下降 [2]。2010年，有研究基於角膜圖像技術，發現角膜清晰度變化與PMI有較好相關性[3]。但該方法同時要求眼角膜始終暴露於空氣中，尚不能用於實際案件檢驗。
1.2 角膜厚度與PMI的關係
1723年，Petit等[4]應用解剖學方法直接測量角膜厚度，認為死後屍體角膜組織水腫增厚，所測值大於正常值，且測量方法和人為因素對結果影響較大。隨後有研究應用光鏡測微尺測量死後不同時間點的角膜厚度，結果發現在一定時間範圍內角膜厚度會隨著PMI的延長而逐漸增加[5]。2008年，朱少華等[6]應用透射電鏡和圖像分析系統相結合的方法，發現角膜基質膠原纖維直徑隨PMI的延長逐漸增大，可作為PMI推斷的一項指標。2012年，呂國麗等[7]應用超聲法測量死後24h內角膜厚度變化情況，發現兔角膜上皮完整組角膜厚度的變化值與死亡時間呈非線性相關，且具有較強的相關性，解決了無損檢測角膜厚度以推斷死亡時間的難題。2013年，李曉娜等[8]用石蠟包埋切片染色的方法，結合圖像分析軟件研究了兔死後72h內角膜上皮層厚度、角膜基質層厚度與全角膜厚度變化規律，發現角膜基質層厚度和全角膜厚度均在死後12h~54h呈規律性增加，與PMI之間呈較好的線性關係。
1.3 角膜內皮細胞與PMI的關係
角膜內皮細胞結構比較單一，易於染色觀察，同齡個體間角膜內皮細胞密度穩定，不可再生，無性別和種族差異，且位於角膜的最內層，受外界環境因素影響較小[9]。因此，許多學者以角膜內皮為實驗對象，進行角膜內皮細胞活性率和角膜內皮細胞核DNA變化與PMI關係的研究。
20世紀90年代，宋國林等[10] 對死後24h內的已知PMI的500只非正常死亡者的眼角膜行茜素紅-曲利苯蘭聯合染色，觀察角膜內皮細胞活性率（endothelial cell living rate, ECLR）的變化情況，結果顯示死後24h內ECLR與PMI存在著明顯的負相關，可據此推斷PMI。2014年李曉娜等[11]研究兔死後72h內角膜內皮細胞形態學變化與PMI的關係，結果發現ECLR下降趨勢呈現先慢後快的特點，與PMI具有較好的相關性。因此，通過檢測角膜內皮細胞的活性率為較好地推斷PMI提供了一種可能。
由於角膜本身無血管，細胞排列規律，能避免不同細胞受管腔內溶解酶的影響不同，保持細胞核DNA降解的穩定性。劉承泉等[12]對家兔角膜上皮細胞和角膜內皮細胞進行DNA含量與PMI關係分析，發現家兔死後72h內角膜上皮細胞核和內皮細胞核DNA降解速率與PMI具有顯著的相關性。2010年，鄭吉龍等[13]應用單細胞凝膠電泳技術（single cell gel electrophoresis, SCGE），檢測兔死後48h內角膜內皮細胞核DNA降解情況，發現兔角膜內皮細胞彗星樣細胞出現率隨死亡時間增加而逐漸增加。該技術可觀察性較好，但可觀察的參照指標較少，仍未能應用於實踐。
1.4 角膜蛋白與PMI的關係
水通道蛋白1（Aquaporin-1, AQP1）屬於水通道蛋白家族，其存在於角膜內皮細胞、基質細胞等多處部位，有研究表明其參與房水與角膜之間的水轉運。基於個體死後AQP1逐漸降解的原理，有學者通過檢測死後角膜水通道蛋白1(AQP1)含量的規律性變化以推斷PMI，其結果的有效性和可靠性有待進一步觀察[14]。
2 視網膜與PMI推斷
由視網膜來推斷PMI是近幾年興起的一個研究熱點，視網膜位於眼組織的最內層，受外界環境因素的影響小。2007年，陳曉瑞等[15]應用複合熒光RT-PCR技術，發現大鼠死後28h內視網膜細胞β-actin、Pgk1和Rp14 等3個管家基因的mRNA含量隨PMI的延長而下降，呈顯著負相關。該法解決了檢材含量低、敏感性不高、形態不易觀察等難題，但只能對死後細胞mRNA降解作定量分析，不能檢測mRNA動態變化。2009年，彭新等[16]使用改良Feulgen-Vans染色和圖像分析技術檢測大鼠死後28h內視網膜細胞核DNA含量變化情況，發現視網膜細胞核DNA與PMI亦具有良好的相關性。2010年，方超等[17]運用SCGE技術觀察豬死後24h內眼視網膜細胞DNA降解規律，結果顯示彗星頭DNA含量隨著PMI的延長而逐漸下降，這為探討屍體眼球視網膜細胞核DNA降解規律推斷PMI提供了初步實驗參考數據。
3 玻璃體液與PMI推斷
玻璃體液位於眼球內部，受眼眶保護，即使頭部受到嚴重損傷，玻璃體液與血液、腦脊液相比，不易受影響。目前，用於推斷PMI研究較多的有氨、尿素氮、肌酐、葡萄糖、無機鹽離子（尤其是K+）、次黃嘌呤和酶類等。
3.1 玻璃體液中氨、尿素氮、肌酐、葡萄糖與PMI的關係
早在1978年，Oever[18] 發現猝死屍體玻璃體液中氨值會隨著PMI的延長而規律性升高，同時死亡原因和環境溫度也會影響氨值變化。1980年，Schoning等[19]研究不同環境溫度下玻璃體液的生化成分變化與PMI的關係，發現環境溫度在4℃溫度下狗死後48h內玻璃體液中的肌酐和尿素氮隨著PMI的延長而緩慢上升，但在較高的溫度下穩定較差。1989年，Piette[20]肯定了測定死後玻璃體液中肌酐水平以推斷PMI的可行性，並建議結合其他參數以準確推斷PMI。1992年，Henke等[21]以新西蘭大白兔為研究對象，結果顯示死後4h和8h內血清和玻璃體液尿素氮濃度與PMI存在著明顯的正相關。2006年，陶濤等[22]發現玻璃體液內葡萄糖濃度在死後迅速下降，死後24h左右為零。但該方法需排除引起血糖升高的因素，如糖尿病、寒冷天氣、劇烈運動、含糖飲食等因素的影響。
3.2 玻璃體液中無機鹽離子與PMI的關係
玻璃體液中包括多種無機鹽離子，死後無機鹽離子濃度變化規律是推斷PMI的重要方法之一。死後由於睫狀體的主動轉運功能消失，會導致玻璃體液中鉀離子含量升高。
1963年Sturner[23]通過檢測54例屍體玻璃體液中鉀離子濃度，首次建立了鉀離子濃度與PMI關係的迴歸方程式。2002年龔志強等[24]在家兔死後96h內不同時間點檢測了眼玻璃體液中多種金屬元素的含量變化，結果顯示鉀離子、鎂離子等13種元素含量與PMI顯著相關。2010年耿文靜[25]等運用全自動生化檢測儀和超高效液相色譜分析儀進行檢測，證實了玻璃體液中鉀離子濃度可用於推斷死後位於空氣中的屍體PMI，而玻璃體液中鈉離子和氯離子濃度變化可用於推斷淡水中屍體PMI。由於研究中提取方法、取材位置、檢測方法及左右眼等諸多實驗方法和干擾因素的差異，學者們各自建立的迴歸方程式也會存在差異，這使研究結果的應用受到一定的限制。
3.3 玻璃體液中次黃嘌呤與PMI的關係
次黃嘌呤(Hx)的形成與機體缺氧狀態有關，玻璃體液中Hx被認為是推斷PMI的一項重要參數。1991年， Rognum等[26]用高效液相色譜法檢測87例屍體玻璃體液中Hx濃度，發現Hx濃度隨著PMI的延長而呈線性升高，呈顯著的正相關，且其濃度變化受溫度影響。和玻璃體中鉀離子濃度變化相比，Hx濃度檢測更適用於在生前無缺氧的屍檢案例，尤其是死後24h內結果更可靠。2002年，Muñoz等[27]發現玻璃體液中Hx濃度在縊死中的含量增長速度遠大於非縊死組，提示Hx濃度來判斷死亡方式具有一定的研究意義。2010年，Muñoz [28]基於不同死亡方式下玻璃體液中K+、Hx和尿素（U）濃度變化建立了2個不同的迴歸方程式的軟件，該軟件推斷PMI比以往的線性迴歸方程式結果更加準確。
3.4 玻璃體液中酶類與PMI的關係
2004年，李興彪等[29]應用牛磺酸鈉法對家兔進行急性胰腺炎造模並處死，檢測兔死後不同時間點玻璃體液中澱粉酶濃度變化情況，發現兔死後72h內玻璃體液中澱粉酶濃度與PMI之間具有相關性。2005年，王偉平等[30]用光度法檢測不同溫度下家兔死後54h內玻璃體液中谷草轉氨酶(GOT)和膽鹼酯酶(CHE)的活性變化情況，結果顯示在一定時間內這兩種酶的活性會保持在一定的水平，而後會迅速下降，與PMI呈現顯著的負相關。同年，劉承泉等[31]發現玻璃體液內羥丁酸脫氫酶(HBDH)、乳酸脫氫酶(LDH)的活性變化與PMI之間存在顯著的負相關。
3.5 玻璃體液物理特性與PMI的關係
2001年，龔志強等[32]發現家兔死後0～72h眼玻璃體液消光度與PMI呈線性正相關，可依此推斷PMI。2008年，周睿卿等[33]首次將電導分析法應用於法醫學PMI推斷，發現 30℃和20℃下家兔死後玻璃體液電導率隨著PMI的延長而持續升高，電導率變化與PMI之間存在著顯著的正相關。
4 房水與PMI推斷
房水與玻璃體液相比，呈水樣流動性，易於抽取。其位於角膜後部、晶狀體前部，在健康狀態下不含有細胞成分，檢測無機鹽濃度受細胞干擾的可能性小。2010年，呂國麗等[34]用注射器抽取房水，並提取玻璃體液做對照，應用自動生化儀檢測兔死後24h內眼房水鉀離子濃度變化情況，發現利用房水鉀離子濃度推斷PMI可獲得較好的準確度，房水比玻璃體液更適合PMI推斷。但是由於房水量少且易滲透，在溫度高的情況會加劇腐敗與滲透，導致房水消失，故利用房水推斷PMI只能適用於低溫下或死後早期PMI推斷[35]。
5 展望
儘管目前應用眼組織變化推斷死亡時間的方法比較多，但是仍沒有一種方法能安全、可靠、準確地應用於法醫工作實踐之中。如何建立一種可靠安全的PMI推斷方法，則需要我們結合法醫檢案實踐工作，利用眼球相對隔絕、受外界因素影響較小的優勢，選擇一個或者若干個相對穩定的觀察指示參數，通過不斷地進行造模排除比較大的干擾因素，擬定出系統規範化的觀察標準，在後期動物實驗研究的基礎上，嘗試進行人類屍體研究，從而使利用眼組織推斷PMI的方法更趨近客觀真實，期望成為一種用於法醫學PMI推斷的普遍適用的方法。
閱讀更多 問法問醫 的文章
