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上一讲我们说了怎么做石蜡切片，这一讲我们继续说说怎么做冰冻切片。
冰冻切片
如果说石蜡切片可以切得很豪放，那么冰冻切片做起来就比较受限制了，受什么限制呢？答案是：温度。我们从字面来看，冰冻切片，当然需要温度比较低，一般用零下20℃（-20℃）。所以做冰冻切片第一个准备工作就是打开冰冻切片机预冷。在切片机预冷的一两个小时里，我们可以做其他的准备工作，包括：刀片、载玻片（防脱）、O.C.T.胶、镊子、卷纸、铅笔（这里有个重要的小动作，请参见小贴士1）。请记得把刀片和镊子也放到切片机里面预冷，但是，载玻片，不！要！放！本侠解释一下原因，刀片、镊子和载玻片都是要直接接触O.C.T.胶的，O.C.T.胶常温时呈液态而-20℃时呈固态，而上上讲（没写错，就是上上讲）里面我们也说过O.C.T.胶是用来裹在组织外面帮助切片成型的，所以我们希望的理想状态是，刀片和镊子在切片时接触O.C.T.胶可以保持胶的固态以保证顺利切片，而载玻片在贴片时接触O.C.T.胶可以瞬间将胶融化为液态以帮助组织迅速贴到载玻片上。所以为了实现这个理想，我们要将刀片和镊子的温度也预冷到-20℃，而将载玻片保持常温。
图 1
待冰冻切片机预冷完毕，首先穿上一件长袖、较厚的白大褂，尤其是夏天，因为我们的两只胳膊是要伸进切片机-20℃区域操作，而且时长一般是以小时计的。做好保护工作，再把组织从冰箱取出来，放进切片机保持低温状态。冷冻切片第一步，把组织固定到冷冻头上。首先取一个你中意的冷冻头（冷冻头一般有好几个，长相如图2所示），接下来有个操作，本侠自己发明的，本侠为此得意了好几年，现在本侠无私地公开给所有粉丝，那就是在冷冻头上夹一个自制O.C.T.胶成型器（这个神器怎么做，请参见小贴士2，神器长相如图3所示）。这个成型器有什么用呢？容本侠解释。由于组织和冷冻头都是固体，所以我们想把组织固定到冻头上，必须借助液态的O.C.T.胶把组织“粘”到冷冻头上。这一步的具体操作是把组织用镊子夹到冷冻头上，然后挤点O.C.T.胶将组织完全淹没，然后把冷冻头放回冷冻头架上，耐心等待O.C.T.胶凝固。一旦O.C.T.胶完全凝固，这一步操作就完成了。说了半天好像也用不上O.C.T.胶成型器呀，表急。由于O.C.T.胶是凝胶状的，所以它被挤到冷冻头上时边缘是不规则 的，这就导致切片的时候不易形成规则且完整形状而导致切片不那么顺利。所以这时如果用上一个O.C.T.胶成型器，我们就能得到一张张边缘整齐的圆形切片，就像方形的石蜡切片那样完美。
图2 冷冻头
图3 O.C.T.胶成型器
准备好标本，把冷冻头连标本固定在切片机上，安装刀片（注意事项可参考石蜡切片），开始修片。没错，冰冻切片同样需要修片。修片时使用的切片厚度可以用10μm、15μm，再厚点也可以。由于冰冻切片具有易融、易裂的特点（这是本侠理解的），所以正式切片的厚度比石蜡切片略厚一些，一般用5μm ，再厚一些也是有的，有小伙伴甚至用10μm。与石蜡切片不同，冰冻切片每一片切下来都是独立的（这里请参见小贴士4），不会首尾相连地粘在一起，这倒是给贴片提供了方便。但是，冰冻切片的贴片步骤真正方便之处并不在此，而是冰冻切片的本质——冰冻。刚刚我们说过，O.C.T.胶常温时呈液态而-20℃是呈固态，所以当固态的O.C.T.胶遇到常温的载玻片时立刻融化，这个过程很自然地将组织吸在了载玻片上，于是一张冰冻切片就制作完成了。切好的冰冻切片如果不需要马上染色，可以放到切片盒，存到-80℃直到你什么时候想起它们。
关于切片我们就说这么多，下一讲本侠想跟大家说说怎么做免疫组化染色。
猪猪侠小贴士
1、本侠在准备工作里列举的所有物品不包括冷冻头，因为本侠默认冷冻头是一直放在切片机里面的。如果有小伙伴使用的切片机冷冻头每次用完是拿出来保管的（很多公用的切片机为了防止私自使用会采取这种方法），请一定记得，预冷切片机的时候把冷冻头也一起放进切片机预冷 ，原因同刀片和镊子。
2、前方高能：本侠自制O.C.T.胶成型器。取一个20ml注射器，去掉针头和注射器芯，留外面那个有刻度的管儿。请注意了，我们需要的是装注射器芯的那头（也就是打针的时候食指和中指接触的那头），而不是装针头的那头，接下来找一个美工刀或者剪刀，把管儿切下2cm左右，自制O.C.T.胶成型器就做成了。最后再找两个最小号的长尾夹，把成型器夹到冷冻头上就可以使用了。每每想到这个神操作，本侠都忍不住暗自点赞。
3、冰冻切片机里的多个冷冻头其实是用来给切多个样本节省时间的。我们用O.C.T.胶把组织“粘”到冷冻头上，等待胶凝固其实是需要一点时间的，如果我们每次都是等切完一个组织，然后把组织拿走，再用卷纸把冷冻头擦干净，接着准备下一个样本，这样很浪费时间，所以一般切多个组织，都是把能用的冷冻头都用上，一次冻上一批组织，然后每切完一个，空出来一个冻头，再冻上新的组织，这样比较节约时间。
4、切冰冻切片跟切羊肉卷本质上一毛一样，所以有个现象也一毛一样，那就是切下来的
切片会成卷。所以切片机自带了一个防卷的玻璃板，切下来的切片会自动压到玻璃板下面变平。但是玻璃板使用久了，切下来的切片不一定能准确地插进玻璃板和刀片之间的缝隙，所以本侠直接用镊子把切片夹下来，但是这个操作有点难度，因为是边切边扽，也就是刀片刚切开一点点胶的时候，镊子就要夹住切片，然后随着刀片继续切，镊子引着切片往下走，直到切片完全切下来。如果有小伙伴很悲催地遇到了不好用的玻璃板，并且同时又有点不那么心灵手巧，那么可以选择任由切片成卷，等卷掉下来，用镊子（最好是弯头）头插进卷里，打开镊子把卷撑开，然后保持镊子撑着卷的状态（这时卷会挂在镊子上），把卷放到载玻片上贴片，效果也很好。5、切完的组织用PBS洗洗可以回收的，因为被切过的组织仅仅是变小了而已，组织还是那个组织，只是外面粘了点胶。
6、关于切片（包括石蜡和冰冻）的操作，本侠几乎没有提及关于切片机的具体操作步骤，比如切片机怎么开机、怎么打开刀片夹又怎么关上、怎么调切片厚度等等，原因是这些操作跟具体机型直接相关 ，而且如果你能找到一台切片机使用的话，你肯定也能找到一个会使用机器的人教你怎么用。
以上！
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