腸道不同部位的微生物群落的代謝情況

導讀

結腸部位的微生物群落可調控眾多營養物質複雜的化學轉化過程並釋放出具有不同生物學效應的代謝產物。但目前對結腸內部縱向代謝動力學的研究還是十分有限的。本研究藉助於氣相色譜質譜聯用技術和液相色譜質譜聯用技術，分析了人類腸道微生物生態系統模擬器的升結腸（AC）、橫結腸（TC）和降結腸（DC）區域中特定微生物群落的代謝譜。比較分析的結果顯示，就短鏈脂肪酸產量、代謝譜和膽汁酸的轉化而言，AC、TC 和 DC 區域的代謝之間存在很大的差異。宏基因組評估結果顯示，不同區域的代謝輪廓與微生物群落組成和遺傳潛能之間存在強相關性。總之，本研究為深入瞭解不同區域微生物群落的代謝差異提供了重要參考，並有助於更好的理解腸道菌群結構與功能之間的關係。

論文ID

原名：Metabolic Analysis of Regionally Distinct Gut Microbial Communities Using an In Vitro Platform

譯名：宏基因組和代謝組分析揭示了腸道不同部位的微生物群落的代謝情況

期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry

IF：3.571

發表時間：2019.11

通訊作者：Jenni Firrman

作者單位：美國農業部農業研究局東部地區研究中心

實驗設計

所有的培養試驗均採用人類腸道微生物生態系統模擬器（SHIME）進行。該系統組成主要包括以下幾個腸道區域：胃（St）、小腸（Si）、升結腸（AC）、橫結腸（TC）和降結腸（DC）。AC、TC和DC區域用於培養腸道菌群。用於接種的菌種購於OpenBiome公司，由隨機選取的健康成年人的糞便樣本組成，該成年人日常食用典型的西方飲食。接種後，通過每天飼餵3次組合培養基及含有消化酶的胰液以維持該系統的正常運行。營養物質從胃的區域開始流動，然後從 DC 區域流出。將該系統運行兩週以保證其穩定性。收集穩定後三個時間點的樣品，用於DNA測序和進一步分析。

將來自一位捐贈者的糞便接種於SHIME系統的兩個單元中進行培養，分別標記為樣本重複 1 和樣本重複 2，待其至穩定後用於短鏈脂肪酸的產量分析和非靶向代謝組學的分析。採用鳥槍法進行測序以確定腸道菌群穩定的群落組成。收集 AC、TC 和 DC 區域的兩個重複樣本用於非靶向代謝組學分析和短鏈脂肪酸的定量分析。

將來自三位捐贈者的糞便接種於SHIME系統中以對比個體差異。將來自每一位捐獻者的糞便分別接種於單個SHIME系統中，分別標記捐獻者 1、捐獻者 2 和捐獻者 3，進行培養直至穩定，用於觀察膽汁酸的轉化。採用16S rRNA基因測序確定每個區域中微生物群落的組成。收集不同時間點的樣本用於膽汁酸定量。

結果

1 結腸不同區域之間的代謝譜比較

採用非靶向代謝組學技術對體外模擬器的 AC、TC 和 DC區域收集腸道微生物樣品進行代謝譜分析。計算代謝物的皮爾遜相關係數以確定組間和組內樣本之間的相似度（圖 1）。分析結果顯示大多數都是呈現正相關，且結腸區域內的正相關性最強。例如，糞便中的代謝物與其他糞便樣品之間的相關性最強。來自不同結腸區域的樣本之間表現出一種有趣的模式，即AC 區域的樣本與其他區域樣本之間的相關性強度下降。而TC 和 DC 區域的樣本之間存在較強的相關性，這兩個區域之間的區別很小。從而就導致了 AC 與 TC或 DC 區域之間的分離。負相關性僅出現在 Si區域和糞便樣本之間，且強度很弱。

圖 1 代謝輪廓的皮爾遜相關性分析。將每個樣品中鑑定出的代謝物進行相互比較以確定相相關性的強度和方向。正相關以藍色顯示，負相關以紅色顯示。相關性強度由顏色深淺表示。

基於 Ward 最小方差聚類方法繪製聚類熱圖，以比較不同區域微生物群落產生的各種代謝物的丰度（圖 2A）。根據聚類分析的結果可以得出以下結論：

① 小腸部位存在大量的代謝產物，而這些代謝物在 AC 區域並未發現，這表明這些代謝產物可能被AC區域的菌群利用了併產生了一些替代性的副產物。

② 與其他結腸區域、DM 和 Si 區域相比，AC 區域的代謝產物數量最少。

③ TC 和 DC 區域代謝物數量和種類高度相似，但與 AC區域截然不同。從圖表上方的系統樹圖中形成的分支就可以看出，TC 和 DC區域的代謝譜非常相似，而與 AC 區域的代謝譜相似度不高。與其他結腸區域的菌群相比，AC區域的代謝譜與對照組的相似度更高。

④ 在熱圖的底部可以看到，在結腸三個區域中存在一組核心代謝物。從系統數樹圖中的分支可以看出，它們之間存在相關性，且根據顏色強度可以判斷出它們在AC 與TC或 DC 區域之間的數量增加。

⑤ 從熱圖的頂部可以看到，有一組代謝產物主要存在於糞便中。根據系統樹圖中形成的分支可知，這些代謝物與在結腸區域發現的那組核心代謝物差異很大。糞便中發現的這些代謝物可能是由於暴露於空氣中產生的，亦或是由於哺乳動物細胞產生並殘留下來的。

⑥ AC 和 TC區域之間代謝物多樣性和數量的差異表明TC區域的代謝物產量穩健。由於這些代謝物不存在 AC區域，所以可以得出結論這些代謝物並不是積累的代謝物，因為營養物質是從 AC 區域經 TC 區域流向DC 區域的。相反，TC 和 DC區域之間的代謝物輪廓的相似性表明DC 區域積累的營養物質來源於 TC 區域。

為了進一步探明這些菌群代謝物之間的相似性和差異性，對其進行了主成分分析（圖2B）。AC和 TC 或 DC 區域的樣品在主成分 1 軸上可以分開，說明AC 和 TC 或 DC 區域之間的差異在代謝組數據的變異性來源中排首位。來源於 TC和 DC區域的樣品，儘管彼此分開，但仍分佈在主成分模型中相同的區域。該主成分分析的結果與聚類分析得出的結論一致，

圖 2 不同區域之間的代謝輪廓比較。將來自每個腸道區域的樣品的代謝輪廓進行相互比較以評估相似性和差異性。（A）使用分級聚類模型表示樣本的代謝輪廓（B）使用主成分分析模型表示樣品的代謝輪廓。

2 基於群落結構預測代謝活動的區域性差異

DNA 測序結果和代謝組學分析結果均說明了不同區域輪廓的發展變化，儘管TC 和 DC區域存在明顯的相似性。為對群落結構與所產生的代謝物進行比較，開展了Mantel檢驗和Procrustes統計分析。Mantel檢驗結果顯示，群落組成與它們所產生的代謝物之間存在顯著相關性(r =0.8231; p = 0.001)。Procrustes統計分析結果顯示群落結構與代謝輪廓互相吻合（圖 3）。這些結果均表明可以通過群落結構預測代謝譜。

圖 3 群落結構與代謝產量之間的Procrustes分析。將每個樣品的群落組成與其代謝產物進行比較。

3 對特定區域結腸微生物群落產生的短鏈脂肪酸進行定量與評價

短鏈脂肪酸是腸道菌群進行厭氧發酵的最終產物。為了深入瞭解結腸不同區域代謝終產物的差異，本研究藉助於氣相色譜質譜聯用技術對短鏈脂肪酸進行了定量分析（圖 4）。定量結果顯示，乙酸、丙酸和丁酸佔比達 95%，總濃度在80~120 mmol/ L範圍內，該結果與之前的報道結果一致。在體外培養系統中，DC區域中總短鏈脂肪酸、乙酸、丙酸、丁酸、2-甲基丙酸和 3-甲基丁酸水平最高，這些代謝物在AC 區域和 TC區域的含量之間不存在顯著差異。有趣的是，戊酸是唯一一種在系統中（AC經TC到DC區域）依次增加的短鏈脂肪酸。

由這些數據可知，AC 區域內包含了大部分的（70%）短鏈脂肪酸，TC 和 DC區域的短鏈脂肪酸含量較少（圖 4）。這也支持了之前的觀點，即大多數短鏈脂肪酸都是營養物質在近端結腸被分解產生的。因為這個體外系統旨在於模擬體內發生的反應過程，所以將組合培養基混合物首先添加到AC區域。組合培養基中含有許多膳食多糖，如阿拉伯半乳聚糖、果膠和木聚糖以及抗性澱粉等，這些營養物質會被微生物群落髮酵生成短鏈脂肪酸。在這個體外培養系統中，營養成分從 AC 區域被輸送到 TC區域。TC 區域中的大部分短鏈脂肪酸是由AC 區域轉移過來並積累的，很少量或者並沒有是自己發酵產生的。然而，也有可能是TC 區域內的菌群自發產生並利用了這些短鏈脂肪酸。實際上，有很多研究表明腸道微生物群具有將乙酸轉化成丁酸和其他終產物的能力。雖然根據我們的數據無法確定是否正在發生這種情況，但我們的結果證實事實並非如此。如果是TC 區域細菌發生乙酸代謝活動，則可以合理的預測TC區域的丁酸含量會增加，但我們並沒有觀察到這種現象（圖 4）。

DC 區域內短鏈脂肪酸的數量顯著增加，說明產生了一些代謝物。但是，多糖和澱粉不太可能進入 DC 區域，因為它們很容易就被上游的菌群分解。這個假說也得到了一項報道的證實，該報道稱遠端結腸區域中剩餘的可發酵的底物較少。短鏈脂肪酸的增加可能是由於進入培養系統的一些蛋白質水解所致，因為蛋白質的發酵程度在高pH值環境下會升高。蛋白質水解的主要產物是支鏈短鏈脂肪酸。在該培養系統中檢測到了兩種短鏈脂肪酸，即2-甲基丙酸和3-甲基丙酸，這兩種支鏈短鏈脂肪酸從TC到DC區域均顯著增加（圖 4）。與 TC 區域類似，DC 區域的大部分短鏈脂肪酸也可能是由於上游流入並積累所致。

圖 4 每個結腸區域產生的短鏈脂肪酸定量結果。使用 GC-MS 測定乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、2-甲基丙酸、3-甲基丁酸和總SCFA的含量。

4 短鏈脂肪酸產量與水解酶基因的群落結構和豐度的相關性分析

為了將微生物群落結構與短鏈脂肪酸的產量聯繫起來，我們進行了鳥槍法宏基因組測序。我們找到了與三種主要短鏈脂肪酸中任意一種顯著相關的菌群。這三種短鏈脂肪酸主要包括乙酸、丙酸和丁酸或戊酸，戊酸是唯一一種在三個區域之間含量增加的短鏈脂肪酸。幾乎所有的相關性都是正相關，且這四種短鏈脂肪酸的產量與假單胞菌之間的相關性最強。這些結果讓人十分驚訝，因為假單胞菌屬不發酵糖類，所以通常與短鏈脂肪酸的產生無關。之前的研究發現脆弱擬桿菌、梭菌屬和馬賽巨型球菌會產生戊酸。在相關性分析中，梭菌呈弱正相關，但脆弱擬桿菌和巨型球菌與戊酸的產量呈負相關

使用此類型體外培養模擬器的主要限制是系統中並沒有類似於體內的連續吸收過程。體內產生的短鏈脂肪酸可以被腸道上皮細胞吸收併產生多種生物學效應。在體外培養系統中，隨著底物從AC經TC流動至DC區域，短鏈脂肪酸也隨之流動，這與體內真實的生理過程不符。因此，我們認為將菌群的丰度和短鏈脂肪酸的產量直接關聯起來可能不是探究區域群落結構與短鏈脂肪酸丰度之間關係的最佳方法。所以我們採用了另外一種方法進行代替，即評估微生物群落中是否存在GH 基因。

GHs 是指具有碳水化合物活性的酶，可以將多糖、寡糖和糖複合物分解並釋放出短鏈脂肪酸。儘管目前已經鑑定出大量的 GHs，但人們普遍認為擬桿菌和厚壁菌是 GHs 主要來源，而變形菌中則相對較少。將每個樣品的測序讀長與直向同源物的KEGG蛋白數據庫進行比對，並將以EC編號3.2.1開頭的直向同源物鑑定為GH基因。將每個區域內的GH基因進行相互比較，以鑑定從AC區域經TC區域到DC區域存在線性變化的基因。

共鑑定出 25 種 GH 基因呈線性變化。當然，有 20 種 GH表現為依次降低，在AC區域中發現的數量最多，而在 DC區域發現的數量最少（圖5A）。儘管這些基因的存在並不能證明酶會高效的工作，但這些數據可以表明AC 區域內的菌群發酵和產生短鏈脂肪酸的能力最強。這一結論也支持了之前的假說，即該體外培養系統中大部分的短鏈脂肪酸是由AC 區域的菌群產生的。這些數據也說明不同區域內微生物群落的功能能力存在差異。

共有 5 個 GH 基因在系統流動過程中呈線性增加，AC 區域中的數目最低，而 DC 區域的數量最高（圖5B）。藉助於碳水化合物活性酶數據庫對這5 個 GHs的功能性活性進行鑑定。其中 3 種GHs（澱粉-1，6-葡糖苷酶、葡聚糖 1，6-α-糖苷酶和纖維素 1，4-β-纖維二糖苷酶）的功能分別是水解糖原、葡聚糖和纖維素的D-糖苷鍵相連的分支。葡糖澱粉酶水解 D-葡糖糖殘基，而環葡聚糖水解酶水解線性麥芽糊精。在5個增加的GH基因中有3個GH基因涉及水解相同類型的分支鍵，這可能意義重大。此外，DC區域中這些基因的增加在一定程度上可能解釋TC區域和DC區域之間短鏈脂肪酸產量增加的原因。

圖 5 結腸不同區域群落結構中 GH 基因的檢測結果。（A）檢測到丰度依次下降的 GH 基因。（B）檢測到丰度依次增加的 GH基因。

5 特定區域腸道微生物群落對膽汁酸的轉化

腸道菌群的一項重要功能是將初級膽汁酸轉化成次級膽汁酸。採用液相色譜質譜聯用技術對3 個捐獻者每個腸道部位的膽汁酸進行測定（圖6A）。

圖 6 不同區域腸道微生物群落對膽汁酸的轉化。（A）每個捐獻者Si和AC、TC和DC區域中初級膽汁酸和次級膽汁酸的總量。（B）初級膽汁酸（膽酸、鵝去氧膽酸、牛磺膽酸、甘氨膽酸、牛磺鵝去氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸）的定量結果。

膽汁酸分析的結果表明膽汁酸代謝的能力存在區域差異。膽鹽水解酶普遍具有去結合作用，在pH 5-6條件下作用最強。去結合現象可能出現在 AC區域，因為 AC區域的 pH 值保持在 5.6-5.9 範圍內。7α-脫羥基酶將膽酸和鵝去氧膽酸轉化為去氧膽酸和石膽酸，並由膽汁酸誘導操縱子（BAI）編碼。為了找到基因組含量與膽酸轉化的對應關係，我們針對具有膽汁酸轉化功能梭菌（Clostrium scindens，Clostrium hylemonae和Clostrium hyromonae）對區域的菌群進行了監測。然後將這些具膽汁酸轉化功能的梭菌的丰度與鵝去氧膽酸與膽酸或次級膽汁與初級膽汁酸的log10比值進行比較。從比較結果來看，在 AC 區域內，最小的初級膽汁酸到次級膽汁酸的轉化率對應最低丰度的膽汁酸轉化梭菌（圖 7）。TC區域內發生了大量的膽汁酸轉化，但是膽汁酸轉化梭菌的丰度與AC區域相似。這可以解釋為：負責轉化膽汁酸的梭菌屬物種極效率級高，即使在低丰度下也可以引起轉化。此外，菌群的丰度可能低於檢測極限。然而，這可以表明 AC 區域內沒有發生轉化過程可能是由於其他因素導致的，而不是由於膽汁酸轉化菌群的存在與否導致的。DC 區域內出現了大量的膽汁酸轉化，而膽汁酸轉化菌群的數量也相應增加。

圖 7 膽汁酸誘導操縱子（BAI）基因與膽汁酸轉化的比較。

6 代謝譜分析和基因組評估證明了體外培養系統特定區域腸道微生物群落的發展

本研究藉助於非靶向代謝組學、短鏈脂肪酸分析和膽汁酸定量分析相結合的方法評估了特定區域腸道微生物群落的代謝功能。採用宏基因組學的方法探究了這些結果與群落結構和遺傳潛力之間的相關性，以進一步瞭解腸道菌群內部結構與功能的關係。

總之，本研究數據表明體外培養系統AC、TC和 DC 區域的群落之間在代謝方面存在顯著的區域性差異。但是，數據也表明 TC和 DC區域在功能上極為相似。通過非靶向代謝組學分析發現，代謝物類型和豐度的差異更加明顯的說明了這一結論。在研究短鏈脂肪酸的產量和膽汁酸的轉化時，TC區域和DC區域之間存在一些區別。儘管存在爭議，但TC和DC區域之間的相似性要比AC區域更高。TC和DC區域之間的相似性可能是由於短鏈脂肪酸分析中發現的相同累積效應所致。但是，這需要進一步研究加以證實。

本研究結果需要通過對其他更多的捐獻者進行類似的分析進一步加以證實。因為本研究中的非靶向代謝組學分析和短鏈脂肪酸分析是針對一位捐獻者開展的，且膽汁酸定量分析的研究對象也僅為3 位。眾所周知，腸道菌群群落的組成因人而異。因此，由這些群落產生的代謝物也可能是不同的。但本研究在一定程度上確實揭示了腸道菌群的代謝動力學及其與群落結構的關係。特定結腸區域產生的代謝物的類型和數量上的差異可能有助於探明某些結腸疾病主要發生在遠端結腸的原因。

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