當新生RNA與模板DNA通過鹼基互補配對形成雜合鏈時，另外一條非模板DNA鏈將處於單鏈狀態，由此形成的三鏈核酸結構稱為R-loop。R-loop廣泛存在於細菌、真菌、植物與動物的基因組中，並具有廣泛的生物學意義。現已知R-loop在基因轉錄、DNA複製、表觀遺傳修飾以及DNA損傷修復等過程中都具有重要作用，是具有調控功能的核酸結構【1】，而R-loop的水平紊亂則常會導致轉錄與複製失調以及基因組穩定性下降，並由此促進許多重大疾病的發生和發展。隨著對R-loop重要生物學意義的逐漸揭示，近年來對R-loop研究的關注也在迅速上升。
圖片引自：https://en.wikipedia.org/wiki/DRIP-seq
R-loop研究非常依賴能夠準確定位與定量R-loop結構的檢測技術。早期研究主要依賴電鏡、點雜交和免疫熒光等傳統手段。這些方法可以對R-loop的強度和細胞定位做出整體分析，但對單個R-loop結構在基因組的位置與水平卻無法評判。2012年美國加州大學戴維斯分校的Frederic Chedin課題組利用識別RNA/DNA雜合鏈的單克隆抗體S9.6和ChIP技術開發了體外富集R-loop的高通量測序技術DRIP-seq，將R-loop研究帶入到基因組學時代【2】。
利用DRIP-seq，研究者們總結了R-loop在基因組的位置偏好性與核酸序列特徵，並發現了許多參與R-loop 調控的蛋白因子。這極大促進了R-loop生物學的研究進程。然而，DRIP-seq及其改進方法也存在若干技術問題，包括檢測信號的分辨率有限和S9.6抗體的特異性不足。此外，體外富集的DRIP-seq信號能否真實反映細胞內R-loop的水平仍存在爭議。這些問題的解決亟待不依賴S9.6抗體的新測序技術的開發。
近日，來自武漢大學生命科學學院的陳亮研究員與美國加州大學聖地亞哥分校（UCSD）的
付向東教授在Nature Protocols期刊聯合發表論文R-ChIP for Genome-wide Mapping of R-loops by Using Catalytically Inactive RNASEH1，詳細描述了一種可對體內R-loop進行準確定位與定量的新測序技術，命名為R-ChIP。 現已知在哺乳動物細胞中表達兩種核酸內切酶，RNASEH1和RNASEH2，可特異性切割R-loop結構中的RNA部分。R-ChIP通過在細胞中表達外源RNASEH1突變體（對其催化位點進行突變，但保留R-loop的結合活性）可特異性識別體內形成的R-loop，再經過ChIP富集和鏈特異性測序文庫的建立，即可繪製細胞內R-loop的全基因組圖譜（下圖）。該方法具有三個特點:
1)高分辨率,R-ChIP運用超聲而非限制性內切酶實現染色質的片段化，因此R-ChIP鑑定的R-loop區域可達到200個鹼基而非幾千個鹼基的精度；
2）鏈特異性,即使對雙向轉錄區的R-loop信號，R-ChIP也可以準確識別R-loop的方向。
3）高特異性,與一般的ChIP-seq不同，研究者可以使用RNASEH1催化/結合位點雙突變體的R-ChIP數據做為陰性對照，進一步提高R-loop識別信號的特異性。
R-loop是轉錄的產物，但並不是所有活躍轉錄的基因或區域都會產生R-loop，那麼促進R-loop生成的因素包括什麼呢？作者在此前的工作中利用R-ChIP技術對R-loop的動態變化進行監測，發現RNA聚合酶的停滯是促進R-loop形成的重要原因【3】。此外，轉錄區域DNA的GC分佈以及非模板鍊形成的二級結構對R-loop的形成也具有重要影響，這與之前報道一致【2】。在研究R-loop與重大疾病的關係時，作者運用R-ChIP技術發現在骨髓增生異常綜合症（MDS）中，多種剪接因子的突變均造成造血幹細胞R-loop水平的紊亂，從而影響基因組的穩定性與細胞功能維持【4】，提示R-loop異常可能是MDS疾病發生的共同機制，為MDS與白血病的研究和治療提供了全新視角。
事實上，R-ChIP與之前的DRIP-seq及其衍生技術所展示的R-loop全基因組圖譜並不十分相像。主要區別在於：
1）R-ChIP捕獲到到的R-loop信號集中在活躍轉錄基因的TSS區，而DRIP-seq和DRIPc-seq則顯示R-loop信號在TSS下游1-2kb的位置最為富集；
2）R-ChIP數據顯示R-loop的大小在200bp左右，而DRIP等方法檢測到的R-loop信號常常延綿若干kb；
3）R-ChIP很少在基因末端捕獲到R-loop信號，而DRIP等方法則顯示許多基因末端存在R-loop。
這就引發了一個很值得深入研究的問題：是R-ChIP技術無法捕獲到基因組中所有的R-loop，還是DRIP-和DRIPc-seq技術的存在特異性問題？有意思的是，美國康奈爾大學的Samie Jaffrey課題組近期在DRIP-seq的基礎上結合bisulfite conversion（識別R-loop中的非模板單鏈區域）開發了bisDRIP-seq，以提高DRIP-seq分辨率【5】。數據比較結果顯示，相對於DRIP-seq/DRIPc-seq，bisDRIP-seq與R-ChIP的信號分佈更為接近（下圖）。
由於目前對於R-loop的檢測並無所謂“金標準”，因此兩種方法的優缺點還有待未來研究加以判別，這也是領域內很多研究者所感興趣的方向之一。就像很多其他科學問題一樣，關於R-loop的研究也許同樣需要在不同論點的辯證求真過程中不斷前進。
據悉，本文的第一作者是美國加州大學聖地亞哥分校醫學院的陳加餘博士，通訊作者是美國加州大學聖地亞哥分校醫學院的付向東教授和武漢大學生命科學學院的陳亮教授。
原文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41596-019-0154-6
製版人：子陽
參考文獻
1. Crossley, M.P., Bocek, M., and Cimprich, K.A. (2019). R-Loops as Cellular Regulators and Genomic Threats. Mol Cell73, 398-411.
2. Ginno, P.A., Lott, P.L., Christensen, H.C., Korf, I., and Chedin, F. (2012). R-loop formation is a distinctive characteristic of unmethylated human CpG island promoters. Mol Cell 45, 814-825.
3. Chen, L., Chen, J.Y., Zhang, X., Gu, Y., Xiao, R., Shao, C., Tang, P., Qian, H., Luo, D., Li, H., et al. (2017). R-ChIP Using Inactive RNase H Reveals Dynamic Coupling of R-loops with Transcriptional Pausing at Gene Promoters. Mol Cell 68, 745-757 e745.
4. Chen, L., Chen, J.Y., Huang, Y.J., Gu, Y., Qiu, J., Qian, H., Shao, C., Zhang, X., Hu, J., Li, H., et al. (2018). The Augmented R-Loop Is a Unifying Mechanism for Myelodysplastic Syndromes Induced by High-Risk Splicing Factor Mutations. Mol Cell69, 412-425 e416.
5. Dumelie, J.G., and Jaffrey, S.R. (2017). Defining the location of promoter-associated R-loops at near-nucleotide resolution using bisDRIP-seq. Elife6.
BioArt，一心關注生命科學，只為分享更多有種、有趣、有料的信息。關注請長按上方二維碼。投稿、合作、轉載授權事宜請聯繫微信ID：bioartbusiness或郵箱：[email protected]。原創內容，未經授權，禁止轉載到其它平臺
閱讀更多 BioArt 的文章
