撰文 | Gladiator
DNA甲基化在動植物的生命活動中發揮著重要的調節功能, 涉及基因組防禦、異染色質形成、基因印記、X染色體失活、轉座元件沉默等，並在多種腫瘤的發生發展中發揮著重要的作用。哺乳動物中，DNA甲基化主要發生在CpG上，這是與DNA甲基轉移酶DNMT家族蛋白有關【1】。
一般來說，幾乎所有的後鞭毛生物基因組中均含有至少編碼兩個DNMT同系物的基因，分別編碼維持DNA甲基化轉移酶和從頭甲基化酶【2,3】。但也有例外，一種人類真酵母病原體——新型隱球酵母（Cryptococcus neoformans）卻只依賴編碼維持DNA甲基化轉移酶即可維持其必須的甲基化水平。該生物的甲基化依賴於由DMT5基因編碼的胞嘧啶DNA甲基轉移酶（DNMT） Dnmt5。這種酶廣泛存在於真酵母和綠藻中，其中一些已被證明具有CG甲基化功能而影響核小體的定位。Dnmt5家族的具有一個N端染色質域（CD），其後是一個胞嘧啶甲基轉移酶催化域，一個RING以及與SNF2型ATP酶相關的結構域【4】。5mC是真核生物中最常見的DNA甲基化修飾，最近研究表明，
在新型隱球酵母中，5mC主要集中在轉座子富集的重複區域，並可能在轉座子沉默過程中發揮重要的作用【5】。然而，新型隱球酵母Dnmt5是如何在分子水平上參與併發揮甲基化功能還有待深入研究。近日，美國加州大學舊金山分校生物化學與生物物理學系的Hiten D. Madhani課題組在Cell上發表題為Evolutionary Persistence of DNA Methylation for Millions of Years after Ancient Loss of a De Novo Methyltransferase的文章。該研究表明以新型隱球酵母中為研究對象，發現該物種5mC需要DNA甲基轉移酶Dnmt5，特別是對該物種在失去DnmtX酶的背景下如何在進化過程中維持甲基化進行了詳細闡述，並且提出，類似於達爾文基因組進化，表觀基因組已經持續進化了近5億年。
研究人員首先研究了新型隱球酵母中多種促進高效的DNA甲基化機制及相關的因子。 H3K9me，即組蛋白H3第9號賴氨酸的甲基化修飾，是異染色質最重要的表觀遺傳標誌。在新型隱球酵母中，5mC修飾的基因組區域與H3K9me同時發生。通過信號肽結合試驗以及熒光偏振等方法，表明H3K9me是Dnmt5 CD主要結合分子伴侶。為進一步明確是否有其它的因子參與甲基化過程，研究人員通過基因敲除新型隱球酵母的H3K9甲基轉移酶，以及設計多種探針檢測不同區域的甲基化程度，表明除H3K9me以外，還存在其它的分子參與對5mC水平的調控。在此基礎上，研究人員進一步對H3K9me效應蛋白HP1複合體成員進行研究，在對新型隱球酵母HP1同源物Swi6進行敲除後，發現H3K9me通過Dnmt5的CD或Swi6招募Dnmt5來促進5mC。研究人員探討了近期報道的在表觀遺傳學調控中發揮重要作用的一種多功能核蛋白UHRF1(Ubiquitin-like protein containing PHD and RING finger domains 1)，非變性凝膠電泳等試驗證明Uhrf1選擇性地結合半甲基化的DNA，同時結合對Clr4的敲除實驗表明Uhrf1和 Clr4通過兩條不同的途徑影響5mC。
為研究Dnmt5在甲基化調控過程中的分子機制，研究人員分別從體內和體外證明了Dnmt5的甲基化維持酶的特性。體外研究過程中，通過對其底物甲基化狀態以及加入三甲基化的H3K9肽進行體外反應（排除從頭合成甲基化酶活性）的研究表明Dnmt5是一種維持酶，它在體外對半甲基化的底物有活性，且在一定條件下對未甲基化的底物無活性。在體內實驗過程中，為排除Dnmt5可能在體內與其它輔因子共同作用改變其僅作為維持酶的性質。研究人員從細胞中去除Dnmt5使甲基化消失，然後重新引入Dnmt5。通過構建pGAL-DMT5表達系統，研究發現Dnmt5的瞬時抑制可導致5mC的持續損失；通過重新引入RI-DMT5等位基因明確DMT5能夠有效維持DNA甲基化。此外，通過體外構建甲基化外源序列並將其整合到新型隱球菌酵母基因組，研究結果表明Dnmt5能夠在非內源性序列上獨立維持DNA甲基化，並且只限於CG位點。
為了明確在僅有Dnmt5的情況下，新型隱球酵母5mC是如何建立的，研究人員通過分析其所在銀耳科的近源物種中DNA甲基化酶的進行情況，發現一些近源物種同樣具有單拷貝的與Dnmt5同源的編碼基因，而另外一些近源物種在進化過程中出現了DMT5的丟失。而在一些較遠的物種中還預測存在另外一種甲基化酶DnmtX，並推測其可能是一種從頭合成的甲基化酶。進一步通過功能性實驗表明，現存的三種不同物種的DnmtX都能在新型隱球酵母中引發廣泛的DNA甲基化，所有這三種DnmtX在體內都行駛從頭甲基化酶功能，這有力地證明了祖先DnmtX也具有這種功能。為進一步瞭解遠古丟失DnmtX後，5mC維持狀況如何。研究人員對新型隱球酵母開展了實驗進化實驗，通過對其120代的連續觀察發現99.0%以上的5mC位點可以維持。進一步探討5mC模式的遺傳模式，通過對跨越4個主要分枝於5百萬年前分化的C. neoformans var grubii 8個分離株，發現在跨著絲粒區域和包含包含Tcn3元件的雙LTR均存在共有的5mC位點，表明胞嘧啶甲基化位點在不同分離株間相對保守。此外，研究人員還對錶觀遺傳的進化和選擇進行分析，通過一系列的實驗和進化研究表明新型隱球酵母中5mC是高保真度遺傳的，5mC的損失和獲得事件通過產生自然選擇作用的隨機變異，且以一種類似於DNA序列突變的方式進行。
總之，本研究利用多項分析技術並結合多種遺傳學實驗，表明新型隱球酵母在缺乏從頭甲基化酶的背景下，以及數百萬年來如何通過選擇和罕見起源事件如何特異性地維持5mC。因為新型隱球酵母Dnmt5高度特異性維持胞嘧啶甲基化體系的特性，有關該物種的研究將繼續為表觀遺傳記憶的機制基礎和生物學作用提供見解。
原文鏈接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.12.012
參考文獻
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3. Bewick A J, Hofmeister B T, Powers R A, et al.Diversity of cytosine methylation across the fungal tree of life[J]. Nature ecology& evolution, 2019, 3(3): 479-490.
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5. Yadav V, Sun S, Billmyre R B, et al. RNAi is acritical determinant of centromere evolution in closely related fungi[J].Proceedings of the National Academy of Sciences, 2018, 115(12): 3108-3113.
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