大腦由上百億個神經元組成，是結構和功能最複雜的器官，要了解大腦的功能需要對特定類型細胞的基因表達、形態學、生理學以及單個神經元的連接圖譜進行研究。其中一個技術難點在於，在體對單個神經元進行記錄或操控的研究。目前比較前沿的技術就是在體單細胞膜片鉗、用病毒和他莫西芬進行稀疏標記，或者用低效率重組酶來控制基因表達。但是這些方法都存在時空特異性差或者神經元類型不精確等的缺點。
近日，美國Allen Brain研究所在Nature Methods上報道了一種全新的利用光誘導重組酶表達從而標記和控制單個特定類型神經元的方法：RecV。
圖源：Designboom
RecV，其基本的技術原理是：將Cre、Dre、FlpO等特定位點DNA重組酶基因切成兩段，分別接到光誘導變構的真菌蛋白Vivid（VVD）基因上，當有光照射時，真菌蛋白變構致使重組酶兩個片段結合發揮其重組活性，誘導特定的功能蛋白或報告蛋白的表達（圖一）。在細胞上的功能驗證發現，光照5min即開始有報告基因的表達，並隨著光照時間延長表達量增加。
圖一：RecV技術原理
這個光誘導的RecV系統有著出色的光依賴特性，在沒有光照的區域極少甚至沒有非特異性重組（圖二、圖三）；它也可以兼容多個重組酶系統（Cre、Dre、Flp等合用）以及他莫西芬系統實現精確的特定神經元類型的標記和操控；不僅如此，這個系統可以廣泛用於不同種屬模式動物、不同的細胞種類，在斑馬魚中除了標記神經元，還可以標記肌肉、皮膚、心臟等細胞的發育（圖四）。
圖二：表層腦區可以實現侷限誘導表達
圖三：深部腦區也可以實現侷限誘導表達
圖四：斑馬魚上多種細胞的特異性表達
這個系統更加牛的地方在於可以誘導特定的單個神經元及其神經網絡的標記和控制，結合fMOST技術追蹤單個神經元的全腦投射。
fMOST是fluorescence micro-optical sectioning tomography的縮寫，是由我國華中科技大學武漢光電國家研究中心、海南大學校長的駱清銘院士團隊發明的高速、高分辨率熒光顯微光學切片斷層成像技術，它能夠同時對多個神經元的全腦投射進行清晰重構，為我們認識大腦拓寬了視野（圖五）。
圖五：RecV系統實現皮層單個神經元網絡追蹤
除了能“看見”單個神經元，RecV系統還可以幫助我們“操控”單個神經元。利用雙光子作為誘導光源，可以誘導單個神經元裡功能蛋白的表達，而且由於雙光子高能量造成的誤差率也是可接受範圍（目標神經元10μm範圍內非特異性表達率18%，10-15μm內6-7%），當然隨著光學技術的進步，我們也期待能開發出能量更低、聚焦性更強的光源結合使用（圖六）。
雙光子誘導的單個神經元蛋白表達還可以結合鈣成像、光遺傳、化學遺傳等多種基因編輯技術，我們對大腦連接的認識可以從介觀水平向微觀水平邁進。
圖六：雙光子誘導單個神經元的蛋白表達
RecV系統利用了光誘導的特性在時間上和空間上都讓我們對神經元的結構和功能做到了精確，它應用上的技術兼容、跨物種的靈活性為探索大腦微觀和宏觀奧秘打開了新的大門！
參考文獻：
Yao, S., Yuan, P., Ouellette, B. et al. RecV recombinase system for in vivo targeted optogenomic modifications of single cells or cell populations. Nat Methods 17, 422–429 (2020). https://doi.org/10.1038/s41592-020-0774-3
作者信息
編譯作者： Charlotte（brainnews創作團隊）
校審： Simon（brainnews編輯部）
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