細胞生物學研究中，為了更好而長期地研究細胞生物學功能，需要將良好狀態的細胞保存起來，以備將來使用。
在不附加任何保護劑下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH 改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在﹣130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細胞凍存時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來，待復甦時重新進入生長分裂週期。
細胞分裂
一、實驗前準備
實驗開始前，將凍存管、15 毫升離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無菌超淨工作臺，以紫外線照射 30 分鐘。採用通風機通風 3 分鐘。以 75%酒精擦拭操作檯和雙手。準備好冰盒。
將離心機調節至 800 轉，5 分鐘。水浴箱調節至 37 度恆溫。取細胞完全培養基、DMSO、胰蛋白酶等，放於水浴箱中預熱。
首先消毒雙手和超淨臺。取約 10ml細胞完全培養基放於 15 毫升離心管中。
配置細胞凍存液：凍存液應該提前配製，置於室溫備用，防止臨時配製產生的熱量損傷細胞，按無血清培養基 比 血清 比 DMSO=7:2:1 的比例配置細胞凍存液，其中加大凍存液中血清的比例對於保存某些脆弱的幹細胞以及一些比較珍貴的細胞很有好處的。
按比例加好凍存液組分後，輕輕吸打混勻，置於室溫下待用。
二、胰蛋白酶/EDTA 消化
從細胞培養箱中取出細胞，進行瓶口消毒，棄去細胞原來的培養基。按每 25cm²/ml胰酶/EDTA 消化液比例加入消化液，放入顯微鏡下觀察，待所有細胞變圓後立即拿入超淨臺內，加入2ml細胞完全培養基以立即終止消化。
採用無菌槍頭輕輕吹打細胞表面，注意吹打全部培養表面，可以按照先左右吹打，後上下吹打的方式，取所有細胞懸液放入一干淨的15毫升離心管內。
配平離心：採用天平配平兩端，每分鐘 800 轉，室溫離心 5 分鐘。
細胞培養用血清
三、細胞計數
採用羅氏 CASY-DT 快速細胞計數及活率分析儀進行細胞計數。加入 10ml CASY-ton至以標記 viable 的管子中，加入 100µl 細胞懸液，顛倒混勻三次，可進行細胞計數。可見每毫升懸液中有活細胞總數。
四、細胞凍存
取出凍存管，註明細胞名稱、代數、日期。
離心後，以無菌吸管吸棄上清液，不要吸到底部的細胞沉澱。將細胞沉澱與凍存液充分混勻，根據計數結果，將細胞總數調節至細胞數量為每毫升有 5×10⁵為宜。
將細胞凍存懸液分裝入細胞凍存管中，一般一個兩毫升凍存管裝入 1 至 1.5 毫升細胞凍存懸液為宜。
嚴密封口後，進行程序性降溫凍存：
首先 4 度 30 分鐘，負 20 度 30 分鐘，負 80 度過夜，最後進行液氮保存。
另有一種比較實用的降溫方法：用最少兩釐米厚的醫用棉紗將凍存管緊緊包裹，紮緊，直接放入-70 ℃冰箱，隔夜取出凍存管直接放液氮凍存。或直接採用程序性降溫盒更為方便。
五、注意事項
1、細胞活力及濃度
細胞應在生長良好、緻密度約為 80-90％、數目一般為 106-107 /ml，活力達 90%以上的狀態下凍存。細胞活力差的細胞在凍存後的成活率很小，因此，一定要在細胞旺盛分裂時期凍存。
2、注意冷凍保護劑之品質
DMSO 應為試劑級等級，無菌且無色，可以用 0.22 微米濾膜過濾，或者直接購買無菌產品。以 5-10 ml 小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。
使用 DMSO 前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破壞它的分子結構，以至於降低冷凍保存效果。在常溫下，DMSO 對人體有害，故在配製時最好帶上手套。混勻 DMSO 要快，因為 DMSO 對細胞有毒性，混合後應儘快凍存。尤為值得
注意的是細胞中加入凍存液後，一定要混勻，防止 DMSO 沉澱。
3、提前配製凍存液
凍存液應該提前配製，置於室溫備用，防止臨時配製產生的熱量損傷細胞。
4、實行細胞慢凍的原則
緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶，導致細胞損害。對於大多數細胞來說，每分鐘降 1-3℃是合適的。相反，若不緩慢冷凍，造成的結晶就大，大結晶會引起細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復甦過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。
本期關於細胞凍存的分享就到這裡，現在大家對於細胞的凍存有沒有清晰很多呢？
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