延續上期我們對報告基因的初步認識，今天我們來介紹一下另外的3種類型。
β-半乳糖苷酶基因（β-Gal）報告基因
β-半乳糖苷酶：由大腸桿菌lacZ基因編碼，可催化半乳糖苷水解。
最大優勢是易於用免疫組織化學法觀測其原位表達，是最常用的監測轉染率的報 基因之一。
以鄰-硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）為底物可用標準的比色法檢測酶活性，其檢測動力學範圍為6個數量級。氯酚紅-β-D-半乳吡喃糖苷（CPRG）是另一個可用比色法檢測酶活性的底物，其靈敏度比ONPG高近10倍。以MUG和熒光素二半乳糖苷（FDG）為底物則可用熒光法檢測其活性。此法可檢測單個細胞的酶活性，並可用於流式細胞學（FACS）分析。如以二氧雜環丁烷為底物，可用化學發光法檢測酶活性，其檢測動力學範圍最大，靈敏度最高，與用生物發光法檢測熒光素酶活性的靈敏度相似。
β半乳糖苷酶是動物和微生物基因工程中最常用、最成熟的一種報告基因。
它作為報告基因的應用主要有以下幾個方面：
（1）用於研究啟動子的效能和啟動子不同位點突變對錶達效能的影響；
（2）用於研究表達系統中增強序列等調控序列的功能；
（3）用來衡量載體的表達特性和外源物質對錶達調控的影響；
（4） 以融合基因的形式用於研究外源基因的表達及其規律。
檢測方法：
- 用轉染的細胞製備細胞抽提物。
- 對於每個用於測定的轉染細胞裂解物樣品，混合：
- 100xMg2+溶液—— 3ul
- 1xONPG—— 66ul
- 細胞抽提物—— 30ul
- 0.1mol/L 磷酸鈉（PH7.5) —— 201ul
3. 反應液在 37°C 孵育 30 min 或者直到淡黃色出現。大多數細胞類型中，內源性β-半乳糖苷酶的背景非常低，允許孵育時間長到 4~6 h；
4. 每管加入 500ul 1mol/L Na2CO3 使反應終止。在分光光度計上讀 420nm 波長的光密度值。
常用載體：
氯黴素轉乙酰酶報告基因 ( chlormnphenicol acetyltransferase, CAT)
氯黴素轉乙酰酶報告基因 (CAT)：該報告基因來源於大腸桿菌轉位子9，是第1個用於檢測細胞內轉錄活性的報告基因。氯黴素乙酰基轉移酶可催化乙酰CoA的乙酰基轉移到氯黴素3羥基，而使氯黴素解毒。CAT在哺乳細胞無內源性表達，性質穩定，半衰期較短，適於瞬時表達研究。可用同位素、熒光素和酶聯免疫吸附測定(enzyme—linkedimmunosorbantassay，ELISA）檢測其活性，也可進行蛋白質印跡（Westernblotting）和免疫組織化學分析。CAT與其他報告基因相比，線性範圍較窄，靈敏性較低。
檢測步驟：
1. 轉染後 24~72 h，用 D-PBSA 液洗滌細胞；
2. 將培養板置於冰上，每孔中加入 1 mL 的 Tris/Triton；
3. 將培養板-70℃ 冷凍 2 h；
4. 於 37℃ 下解凍培養板，然後將其置於冰上；
5. 將細胞裂解物移至微量離心管中，以最大速度離心 5 min；
6. 收集上清液，65℃ 加熱 10 min，以滅活 CAT 抑制物質；
7. 最大速度離心 3 min 後收集上清液（細胞裂解物），將上清液保存在-70℃；
8. 從每一樣品中取 5~150μL 細胞裂解物，移至一個 3.5 mL 多聚丙烯閃爍杯中，並且加入足夠的 0.1mol/L Tris，終末體積為 150μL；
9. 設空白杯，加入 150μL 0.1mol/LTris 液，作為陰性對照；
10. 陽性對照：
（a）取 5 個閃爍杯，各加入 150μL 0.1mol/LTris；
（b）將 5μL 的 CAT 標準液加入到每個閃爍杯中，繪製 1、5、10、20、50mU 的 CAT 標準曲線。
11. 在所有樣品杯（包括對照）中，加入 100μL 以下混合液：
（a）84μL 超純水；（b）10μL 0.1mol/LTris；（c）1μL 的氯黴素；
（d）5μL（50nCi）的 14C-CoA；
12. 擰緊杯蓋，於 37℃ 下孵育 2 h；
13. 向所有閃爍杯中加入 3 mL Econofluor，擰緊杯蓋；
14. 上下倒置混勻閃爍杯中成分；
15. 室溫下孵育 2 h；
16. 在一個液閃計數儀上測定 30s 閃爍次數。
注意事項：
1. 在表達質粒擴增與製備一步，要特別注意其純度（不能含RNA和染色體DNA）以免影響轉化效率
2. 製備方法最好選用溶菌酶加Triton10，然後氯化豔梯度離心。
3. 一定要有對照組用CAT酶代替細胞提取液，來驗證反應及層析等過程的可行性，或用Psv:CAT和Psv。cAT表達質粒驗證轉化及重組兩步的正確性。
4. 在製備細胞提取液中最好選用超聲波破碎法，離心前要注意檢查破碎程度。凍融法繁瑣有時破碎不徹底影響結果。
5. 4mmol/L乙酞輔酶A可每次取1.smg溶在500純水中，最好用前配製，配製的溶液可保存於一20℃，但不可超過十天。
常見載體：
熒光素酶（Luc）報告基因
熒光素酶報告基因是指以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統。熒光素酶是能夠催化不同底物氧化發光的一類酶，它可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發出生物熒光(bioluminescence)。
最常用的熒光素酶有細菌熒光素酶、螢火蟲熒光素酶和Renilla熒光素酶。哺乳細胞無內源性熒光素酶，細菌熒光素酶對熱敏感，因此在哺乳細胞的應用中受到限制。螢火蟲熒光素酶靈敏度高，檢測線性範圍寬達7～8個數量級，是最常用於哺乳細胞的報告基因，用熒光比色計即可檢測酶活性，因而適用於高通量篩選。隨著具有膜通透性和光裂解作用的螢火蟲熒光素酶的應用，無需裂解細胞即可檢測酶活性。Renilla熒光素酶催化腸腔素（coelenterazine）氧化，產物可透過生物膜，可能是最適用於活細胞的報告分子。將熒光素酶報告基因載體轉染到細胞中，可用熒光素酶檢測系統靈敏方便地測定熒光素酶基因的表達。
自1986年起，螢火蟲熒光素酶基因被用作測定基因表達的報告基因，獲得了廣泛的應用。Promega公司的pGL3及pGL2系列載體，含SV40啟動子及增強子的不同組合，有助於分析DNA片段的轉錄活性。
熒光素酶報告基因有許多優點：①非放射性；②比CAT及其他報告基因速度快；③比CAT靈敏100倍；④熒光素酶在哺乳細胞中的半衰期為3小時，在植物中的半衰期為3．5小時。由於半衰期短，故啟動子的改變會即時導致熒光素酶活性的改變，而熒光素酶不會積累。相反，CAT在哺乳細胞中的半衰期為50小時。熒光素酶濃度在10—16mol/L（10pS/L）到10-8mol/L（1mg/L）範圍內，熒光信號強度與酶濃度成正比。在理想條件下，可檢測到l0-20mol/L的熒光素酶。
檢測步驟：
（1） 用生物信息學方法分析並預測啟動子區可能的轉錄因子結合位點。
（2）設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒（pGL3-basic）中。
（3）篩選陽性克隆，測序。擴增克隆並提純質粒備用。
（4） 擴增轉錄因子質粒，提純備用。同時準備相應的空載質粒對照，提純備用。
（5） 培養293（或其它目的細胞），並接種於24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。
（6） 將報告基因質粒與轉錄因子表達質粒共轉染細胞。
（7） 提取蛋白並用於熒光素酶檢測。
（8） 加入底物，測定熒光素酶的活性。
（9） 計算相對熒光強度，並與空載對照比較。
常見載體：
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