結核分枝桿菌臨床檢驗與進展

作者：深圳市第三人民醫院（南方科技大學第二附屬醫院）/國家感染性疾病臨床醫學研究中心 馬愛靜 楊梁梓 傅佳鵬 劉志超 錢莘 李國保

據世界衛生組織（WHO）估計，2019年全球估計有1000萬人感染結核病（Tuberculosis, TB），約有120萬人死於結核病[1]。我國是全球22個結核病高負擔國家之一，結核患者數量居世界第二位[1]。

近年來，隨著現代結核病控制策略的廣泛實施，我國結核病控制工作取得巨大成績。然而，由於耐藥結核病的存在以及我國人口密度密集，許多結核分枝桿菌感染者並沒有獲得足夠的初步診斷，日益成為我國乃至全球結核病控制的一大難題。

為解決這個問題，國內外不斷研究新的診斷檢驗方法，以期快速準確地診斷結核病。本文對結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）快速診斷相關的當前技術以及潛在的新興技術進行闡述，並對診斷新技術的發展及應用前景進行展望。

一、傳統檢測技術

抗酸桿菌（AFB）痰塗片染色鏡檢（SSM）是世界範圍內結核病檢查中使用最廣泛的技術，並被WHO推薦在發展中國家的結核病控制中使用，是全程督導化學治療（DOTS）策略的基礎。SSM成本低廉，且對生物安全的要求最低。儘管不能區分死菌和活菌，不能確定藥物敏感性，不能區分結核分枝桿菌複合群和非結核分枝桿菌，且檢測敏感度不高［特別是對於人類免疫缺陷病毒（HIV）攜帶者和兒童而言］，在一些資源缺乏的國家，例如南非，痰塗片鏡檢已替換Xpert MTB/ RIF作為肺結核初始診斷測試[2]。

此外，近幾年來，以實驗室為基礎的結核診斷也取得了顯著的進步。熒光二極管（LED）顯微鏡對比傳統的萋尼氏染色鏡檢（Ziehl-Neelsen acid-fast staining，ZN）具有更高的敏感性，而且能進一步定性，具有操作和成本優勢。在2009年，WHO推薦LED顯微鏡鏡檢替代Z-N鏡檢[3]。金胺O-羅丹明染色（Auramine O-Rhodamine fluorescent staining，AO or AR）是使用熒光顯微鏡觀察抗酸桿菌（包括分枝桿菌）的組織學技術。這種技術被認為是優於萋-尼氏抗酸染色的方法[4, 5]。

二、基於細菌培養的檢測方法

培養方法是MTB檢測的金標準，羅氏培養法、BD BACTEC™分枝桿菌生長指示管法是最常用的MTB檢測方法。前者檢測週期耗時較長，大約需要4周左右，且檢測靈敏度較低；後者是一種非放射性、基於熒光的手動或自動化系統，可用於從各種臨床標本中快速檢測分枝桿菌，該配備的培養基、營養添加劑、雜菌抑制劑價格高昂，不利於基層開展[5]。

基於藥敏試驗的培養方法是目前準確檢測二線藥物耐藥情況的唯一可用方法。但是需要數週才能獲得結果，且對實驗室的裝備和人員有較高要求，還需要一個有效的運輸系統，以確保痰標本的活性。儘管現在已有快速的商業化的液體培養系統可供使用，但由於花費及基礎設施方面的要求，在很多結核病高負擔國家建立具有足夠結核分枝桿菌培養能力的實驗室，進程進展緩慢。

多年來，一些非商業化的更為快速和廉價的培養以及藥物敏感性試驗（DST）方法被開發出來，其中包括顯微觀察藥物敏感性檢測技術（microscopic observation drug susceptibility，MODS）、薄層瓊脂法（Thin-layer agar，TLA）、硝酸還原酶法（nitrate reductase assay, NRA）和比色氧化還原指示劑（colorimetric redox-indicator，CRI）等[6]。

三、免疫學檢測方法

相對於SSM，MTB特定生物標記物的檢測技術可能給MTB感染提供了一個更低成本和更快速有效的篩選工具。

1. 結核菌素皮試試驗（Tuberculin Skin Test, TST）應用結核菌素對機體進行測定，觀察人體能否被引發皮膚遲發超敏反應，以此來判斷人體對於結核分枝桿菌有無免疫力，進而判斷受試者是否曾經感染過結核分枝桿菌。然而，對於已經接種卡介苗（BCG）的人而言，TST試驗會顯示一種假陽性結果；對於免疫功能不全的人則會顯示一種假陰性的結果[5, 7]。

2. γ- 干擾素釋放試驗（interferon-γ release assay，IGRA）是指通過檢測患者全血或分離自全血的單核細胞在 MTB 特異性抗原刺激下產生的γ-干擾素，判斷受試者是否感染MTB的檢測方法[5]。但在實際使用中發現，IGRA在不同地區、不同人群中的特異度和敏感度均存在較大差異。此外，不同IGRA產品使用的抗原、檢測試劑、檢測參數和界值設定等可能存在差異，對最終檢測結果及其判讀有一定影響，且無法區分活動性結核病與潛伏性結核感染[5, 8]。

3. 脂阿拉伯甘露糖（LAM）檢測可以提高HIV感染後期患者對TB可疑性的鑑定。2013年，Alere Determine™ TB LAM Ag 橫向流動試紙檢測成為第一個用於HIV合併感染結核病患者床邊尿檢的商用診斷方法，該方法只需要60 µl的尿液即可在25分鐘之內提供結果[5]。目前，尿液LAM檢測的準確性研究成為主要研究方向。該方法檢測的患者群體具有多樣性，包括肺外結核病患者、無法主動提供痰液的肺結核患者及住院患者等。因此，LAM檢測相較於痰塗片鏡檢以及結核分枝桿菌及利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測（Xpert MTB/RIF）的遞增價值不斷改變[9]。

4. 揮發性有機化合物（Volatile organic chemicals，VOCs）以及結核分枝桿菌其他特異的分子標記物可在5分鐘內自動排除結核感染。最近，作為潛在結核病診斷目標的一些揮發性有機化合物，通過訓練過的袋鼠對人體痰標本的氣味檢測進行了驗證。這些揮發性有機化合物來自結核分枝桿菌的代謝以及人體組織損傷。分析儀器靈敏度的提高促進了該方法的進步[10]。

此外，結核病血液檢測可以衡量患者免疫系統對結核分枝桿菌抵抗的強弱。酶聯免疫吸附試驗 （ELISA）、免疫斑點技術（DIGFA）、免疫膠體金技術、蛋白芯片技術等亦為針對結核分枝桿菌抗原抗體進行檢測的免疫學診斷方法。

四、分子檢測方法

用核酸擴增試驗（NAAT）對結核進行分子診斷，快速且具有高度特異性，並能預測結核分枝桿菌的耐藥性。

1. 環介導等溫擴增技術（LAMP）

LAMP技術在恆溫條件下對目標基因進行擴增，具有特異性高、效率高、速度快的特點，是傳統的NAAT的替代。與超快速提取試劑盒（PURE-TB-LAMP）來協同提取痰液標本結核分枝桿菌的DNA，並消除抑制性物質，加強了對原痰液標本中結核分枝桿菌快速檢測的靈敏性和特異性，並提高了生物安全的措施[11]。

2016年8月11日，WHO在日內瓦發佈了一份最新的推薦書，推薦TB-LAMP法（環介導等溫擴增，loop-mediated isothermal amplification）為發展中國家的基礎醫療單位，例如社區醫院等地方使用的新的結核病檢測方法。這種方法經過評估，可以作為痰塗片檢測方法的替代方案。該檢測方式對實驗室基礎設施、設備的要求較少[12]。然而， TB-LAMP對於塗片陰性的樣本的檢測靈敏性有侷限性，對於交叉汙染、假陽性結果、TB-LAMP結果的用戶依賴性以及需要全面的培訓和質量保證存在可能的風險性[13]。且TB-LAMP法無法檢測出患者的耐藥性，因此這種檢測方法僅適用於非多耐藥結核患者（MDR-TB）。

2. 結核分枝桿菌及利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測（Xpert MTB/RIF）

Xpert MTB/RIF作為一個完全自動化的集成NAAT平臺，包括樣品製備、擴增和DNA檢測，是目前對於結核分枝桿菌最先進的工具。Xpert MTB/RIF可以針對很多現有的商業化的NAAT方法所具有的侷限性進行處理，例如交叉汙染、時間消耗以及實驗室問題等。Xpert MTB/RIF檢測是在一個封閉的系統中進行擴增，在2小時內可同時確認結核分枝桿菌的存在以及利福平抗性突變[14]。與所有的NAAT試驗類似，Xpert MTB/RIF檢測方法的敏感性不如培養方法，但是比塗片鏡檢敏感，提高了結核病患者的細菌學確診比例。

3. 結核分枝桿菌線性探針耐藥檢測技術（LPA）

除了Xpert MTB/RIF，LPA是WHO認可的從痰塗片陽性標本或者結核分枝桿菌菌株中快速診斷TB和MDR-TB的分子試驗[15]。GenoType MTBDRplus LPA是市售可獲得的用於檢測對一線藥物如利福平和異煙肼抗性的方法，以及它的下一代GenoType MTBDRsl，可以檢測對二線藥物例如氟喹諾酮類、氨基糖甙類、環肽、乙胺丁醇和鏈黴素的抗性。

線性探針可以通過DNA雜交技術在2天內從臨床標本中檢測賦予臨床樣品抗生素耐藥性的基因突變。目前，LPA不止可用來快速檢測塗片陽性的標本，同時可用來檢測抗酸桿菌（AFB）塗片陰性而PCR結果陽性的耐藥結核桿菌（DR-TB）[16]。儘管線性探針目前已經被很多國家所採用，作為傳統DST的替代，專家組建議，GenoType MTBDRsl LPA不能用於廣泛耐藥結核病的檢測，因為儘管其對二線藥物抗性檢測具有高特異性，但是靈敏度較低[15, 17]。此外，LPA一般非常昂貴，需要複雜的實驗室基礎設施，因此其在低收入、高負擔的國家的作用和實用價值將需要實地進行評估。

4. 基因芯片耐多藥檢測方法

該方法是一種可以快速檢測結核分枝桿菌對利福平和異煙肼耐藥性的分子生物學方法[18]。與傳統的細菌學藥敏實驗相比，完成整個檢測僅需要6 h，方便快速。人類尿液中含有一些瀕死的體細胞或者微生物中大約300鹼基對的細胞自由片段稱為Transrenal DNA。這些片段是傳染病診斷目標，因為至少在理論上，可以無需侵入受感染的身體組織而將它們擴增。然而在幾個比較小的實踐研究中，檢測尿液中的結核分枝桿菌衍生的Transrenal DNA的靈敏度相差很大[19]。

結核病的診斷是結核病防治的關鍵，現有或新出現的技術在分析前診斷肺結核可以通過優化樣本採集或通過更好地保存樣品的完整性提供漸進式改進。這些方法可以與現有的一些技術（SSM, NAAT或培養）協同以提供更好的診斷結果。同樣，自動顯微鏡系統可以通過改善工作量、效率或資源需求（熟練的工作人員和質量保證）等方式迎接挑戰，提高診斷率。基於NAAT的檢測方法的途徑是傳染源診斷技術的核心，在不同水平的實驗室中都具有不斷髮展的空間與前景。線性探針的範圍很大，一些具體的方法可以提供特異的結核診斷以及藥物敏感性測試。芯片技術可通過降低測試的複雜性提供更大等位基因變異的篩選。這些技術目前面臨的挑戰是對於其用途性能充分的證據。然而，許多技術還缺乏足夠的驗證，以提供其對於提高結核診斷的真正的性能以及潛力。檢測樣本、檢測因子等單一化，程序複雜，成本高昂，不適用於大規模推廣普及。因此，今後的工作尚需尋找新的檢測靶標，發展新的診斷方法，研發新的診斷試劑。

作者簡介

李國保，主任醫師、教授；南方科技大學第二附屬醫院肺病醫學部副主任、肺病三科主任。

長期在臨床一線工作，從事呼吸、結核病、危重症臨床救治工作。在危重結核病、氣管鏡及機械通氣的臨床應用、耐藥肺結核並呼吸衰竭救治、結核性毀損肺的肺保護性機械通氣、危重患者評估、院內獲得性感染等臨床和研究方面，取得了一定的成績。在呼吸系統危重疾病及突發公共衛生事件救治方面有較為豐富的臨床經驗。其在2007年創立的呼吸、危重症學科為深圳市突發公共衛生事件如H1N1、H7N9及本單位呼吸危重疾病救治做出了應有的貢獻並積累了較為豐富的臨床經驗。榮獲省級科技成果獎3項，市級科技成果獎4項，市科技進步獎3項。近年來完成了“十一五”國家重大專項2項，“十二五”國家重大專項1項， “十三五”國家重大專項1項。深圳市科研立項1項。

社會任職：中華醫學會結核病學分會委員、重症專業委員會主任委員；中國醫藥教育協會感染疾病專業委員會委員；廣東省醫學會結核病學分會副主任委員；廣東省藥學會呼吸用藥委員會委員，深圳市醫學會結核病專委會主任委員、呼吸專業委員會常務委員；深圳市醫師協會結核病專委會主任委員。深圳市突發公共衛生事件醫療救治專家組專家。

馬愛靜，女，醫學博士，出生年月1990.03，從事結核分枝桿菌與常見非結核分枝桿菌快速診斷及藥物敏感性研究。

參考文獻

[1] W. H. Organization, "Global tuberculosis report 2019," 2019.

[2] G. J. Churchyard, W. S. Stevens, L. D. Mametja, K. M. McCarthy, V. Chihota, M. P. Nicol, et al., "Xpert MTB/RIF versus sputum microscopy as the initial diagnostic test for tuberculosis: a cluster-randomised trial embedded in South African roll-out of Xpert MTB/RIF," Lancet Glob Health, vol. 3, pp. e450-7, Aug 2015.

[3] W. H. Organization. (2015). Global tuberculosis report 2015.

[4] A. Jain, A. Bhargava, and S. K. Agarwal, "A comparative study of two commonly used staining techniques for acid fast bacilli in clinical specimens," Indian Journal of Tuberculosis, vol. 49, pp. 161-162, 2002.

[5] 馬愛靜 and 趙雁林, "結核病實驗室診斷研究進展," 中華臨床實驗室管理電子雜誌, pp. 33-38.

[6] in Noncommercial Culture and Drug-Susceptibility Testing Methods for Screening Patients at Risk for Multidrug-Resistant Tuberculosis: Policy Statement, ed Geneva, 2011.

[7] E. Lee and R. S. Holzman, "Evolution and current use of the tuberculin test," Clin Infect Dis, vol. 34, pp. 365-70, Feb 1 2002.

[8] M. Pai, A. Zwerling, and D. Menzies, "Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update," Ann Intern Med, vol. 149, pp. 177-84, Aug 5 2008.

[9] J. Peter, G. Theron, D. Chanda, P. Clowes, A. Rachow, M. Lesosky, et al., "Test characteristics and potential impact of the urine LAM lateral flow assay in HIV-infected outpatients under investigation for TB and able to self-expectorate sputum for diagnostic testing," BMC Infect Dis, vol. 15, p. 262, 2015.

[10] G. F. Mgode, B. J. Weetjens, T. Nawrath, D. Lazar, C. Cox, M. Jubitana, et al., "Mycobacterium tuberculosis volatiles for diagnosis of tuberculosis by Cricetomys rats," Tuberculosis (Edinb), vol. 92, pp. 535-42, Nov 2012.

[11] Y. Kouzaki, T. Maeda, H. Sasaki, S. Tamura, T. Hamamoto, A. Yuki, et al., "A Simple and Rapid Identification Method for Mycobacterium bovis BCG with Loop-Mediated Isothermal Amplification," PLoS One, vol. 10, p. e0133759, 2015.

[12] W. H. Organization, "The Use of Loop-Mediated Isothermal Amplification (TB-LAMP) for the Diagnosis of Pulmonary Tuberculosis: Policy Guidance.," 2016.

[13] S. Mitarai, M. Okumura, E. Toyota, T. Yoshiyama, A. Aono, A. Sejimo, et al., "Evaluation of a simple loop-mediated isothermal amplification test kit for the diagnosis of tuberculosis," Int J Tuberc Lung Dis, vol. 15, pp. 1211-7, i, Sep 2011.

[14] C. C. Boehme, M. P. Nicol, P. Nabeta, J. S. Michael, E. Gotuzzo, R. Tahirli, et al., "Feasibility, diagnostic accuracy, and effectiveness of decentralised use of the Xpert MTB/RIF test for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistance: a multicentre implementation study," Lancet, vol. 377, pp. 1495-505, Apr 30 2011.

[15] W. H. Organization. (2013). The use of molecular line probe assay for the detection of resistance to second-line anti-tuberculosis drugs: Expert group meeting report. .

[16] Y. S. Lee, H. R. Kang, S. H. Lee, Y. Kim, M. Y. Kim, J. H. Shin, et al., "Diagnostic usefulness of the GenoType MTBDRplus assay for detecting drug-resistant tuberculosis using AFB smear-negative specimens with positive TB-PCR result," Infect Dis (Lond), vol. 48, pp. 350-5, 2016.

[17] O. Ignatyeva, I. Kontsevaya, A. Kovalyov, Y. Balabanova, V. Nikolayevskyy, K. Toit, et al., "Detection of resistance to second-line antituberculosis drugs by use of the genotype MTBDRsl assay: a multicenter evaluation and feasibility study," J Clin Microbiol, vol. 50, pp. 1593-7, May 2012.

[18] P. Srilohasin, A. Chaiprasert, K. Tokunaga, N. Nao, and T. Prammananan, "Novel DNA chip based on a modified DigiTag2 assay for high-throughput species identification and genotyping of Mycobacterium tuberculosis complex isolates," J Clin Microbiol, vol. 52, pp. 1962-8, Jun 2014.

[19] A. Cannas, D. Goletti, E. Girardi, T. Chiacchio, L. Calvo, G. Cuzzi, et al., "Mycobacterium tuberculosis DNA detection in soluble fraction of urine from pulmonary tuberculosis patients," Int J Tuberc Lung Dis, vol. 12, pp. 146-51, Feb 2008.