小鹿同學 微生態 昨天
導讀
近幾十年來，抗生素使用的迅速增長和高熱量、低纖維飲食的攝入已導致腸道微生物群落的紊亂，使人們更容易患上各種疾病，例如代謝綜合徵。目前微生物群對產後環境的影響已得到了充分地證明，但其對胚胎期腸道微生物群的影響還知之甚少。儘管越來越多的證據支持了健康與疾病發展起源這一概念，但其潛在機制仍不清楚。在這項研究中，作者探討了母體腸道菌群對生命後期胚胎髮育影響，以及其與代謝綜合徵發展起源之間的聯繫。
論文ID
原名：Maternal gut microbiota in pregnancy influences offspring metabolic phenotype in mice
譯名：孕婦母體腸道菌群影響小鼠後代代謝表型
期刊：Science
IF：41.037
發表時間：2020年2月28日
通訊作者：Ikuo Kimura & Koji Hase
通訊作者單位：東京農業技術大學農學院應用生物科學系&慶應義塾大學藥學研究科生物化學部
實驗設計
為了研究孕期母體腸道菌群對後代的影響，研究者首先將懷孕小鼠在無特定病原體（SPF）和無菌（GF）的條件下產仔，統一高脂肪飲食飼餵生長後，通過組織學、生化分析、CT成像等手段對小鼠後代的出生體重、腎周及皮下白色脂肪組織以及肝臟重量、血漿內血糖、甘油三酸酯、非酯化脂肪酸、總膽固醇、胰島素水平等參數進行比較，同時結合16S rDNA測序對小鼠後代的腸道菌群進行分析，從而確定GF後代在高脂肪飲食條件下更容易出現肥胖症；接著研究者通過氣相色譜-質譜鑑定等手段對SPF和GF條件下母體和胚胎的血漿中代謝物（短鏈脂肪酸）進行檢測、比較分析，結合交感神經細胞系、胰腺細胞系和腸道類器官等體外實驗，確定了短鏈脂肪酸-GPR41/43軸與交感神經系統的發育、腸內分泌細胞和胰腺β細胞的分化之間的關係；最後，研究者對相同遺傳背景的小鼠進行了一項高/低纖維飲食干預研究，代謝組分析顯示低纖維飲食干預的小鼠後代具有與GF後代相似的生化指標參數，都出現易肥胖表型。在此基礎之上，研究者對低纖維飲食干預的孕期母體進行了短鏈脂肪酸（丙酸鹽）的補充，發現其後代對肥胖也具有抗性。
結果
無菌（GF）母體的後代與肥胖症的發展
為了研究懷孕期間母體腸道菌群對後代的影響，懷孕小鼠在無特定病原體（SPF）和無菌（GF）條件下產仔。在妊娠的第18.5天，懷孕的GF小鼠接受一個從相應菌株的SPF小鼠體內移植的糞便微生物群，以防止不利微生物的過度生長。新生小鼠被寄養母鼠在常規條件下飼養，從而統一出生後的生長環境。斷奶後，雄性小鼠被飼餵高脂肪食物（HFD）從而誘導肥胖（圖1A）。儘管來自GF ICR母體的新生小鼠在出生後的體重小於來自SPF ICR母體的新生小鼠體重，但是在HFD飲食條件下GF母體的後代會出現明顯的肥胖（圖1A）。此外，在16周時GF母體的後代（GF後代）腎周或皮下白色脂肪組織（WAT）以及肝臟的重量顯著高於SPF母體的後代（SPF後代）（圖1A），這與WAT脂肪細胞大小和肝臟的甘油三酸酯（TGs）的增加相一致。同時，GF後代中血糖、TGs、非酯化脂肪酸（NEFAs）和總膽固醇的水平也顯著升高（圖1B）。GF後代的體溫和心率顯著降低（圖1C），其血漿胰島素的水平和胰島大小顯著高於SPF後代。此外，GF後代出現食物攝入量的增加，而腸道激素肽YY（PYY）和胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）的血漿水平降低（圖1D）以及能量消耗的減少（圖1E）。這些結果表明，GF後代在HFD飼餵條件下表現出肥胖表型。支持該解釋的是，GF後代在HFD誘導條件下出現葡萄糖不耐症和胰島素耐受性的速度顯著增加（圖1F），表明其胰島素敏感性受到了損害。值得注意的是，雌性GF後代也表現出相似的表型。
圖1. 來自GF母體的後代在飼餵HFD後表現出嚴重的肥胖表型。（A）實驗方案（左）。HFD試驗期間的體重變化（中）（每組中n = 14）和組織重量（右）（每組中n = 7~9）。epi：附睪；peri：腎周；sub：皮下注射。（B）血糖、TGs、NEFAs以及總膽固醇的水平（每組中n = 6~11）。mEq：毫克當量。（C）體溫（左）（每組中n=7或8）和心率（右）（每組中n=7）。（D）腸道激素PYY的水平（左）（每組中n=6或8）和GLP-1的水平（右）（每組中n=6）。（E）能量消耗（每組中n=7或8）。（F）葡萄糖耐量測試（左）和胰島素耐量測試（右）（每組中n = 8）。在雄性小鼠16周齡時對其進行了分析。Student’s t-檢驗，**P<0.01>
哺乳動物新生兒最初暴露於陰道微生物群中，這很大程度上促進了嬰兒腸道微生物群落的建立，因此也潛在地影響宿主代謝系統的發育。然而，16S核糖體DNA（rDNA）擴增子測序表明，成年後SPF和GF ICR母體後代構成的腸道菌群的細菌家族的相對丰度相似，儘管與SPF後代相比，嬰兒期GF後代的鏈球菌科和腸球菌科的丰度顯著減少。基於加權UniFrac距離的主座標分析證實，兩組在成年期之間沒有差異，但在嬰兒期存在差異。為了排除陰道微生物群的可能影響，SPF和GF母體的新生兒通過剖宮產的方式分娩。與陰道分娩的後代情況一致，剖宮產GF後代在生長過程中餵食HFD也會表現出嚴重肥胖表型。剖宮產的GF後代在16周時的WAT和肝臟重量、血漿代謝參數和胰島素水平也顯著高於剖宮產的SPF後代。此外，前者顯示出能源消耗的減少。此外，成年期SPF和GF母體的剖宮產後代的腸道菌群組成相似，而分娩方式可能會輕微地影響嬰兒期的菌群，這與最近的一項研究發現一致。總體而言，這些數據表明，成年後的腸道菌群並不是GF後代出現易肥胖表型的主要因素。
腸道菌群和宿主遺傳學之間的相互作用調節了肥胖的易感性，而飲食等環境因素對於調節宿主與微生物的相互作用是必不可少的。儘管ICR和C57BL/6J母體的後代之間腸道微生物組成趨於不同，但它們顯示出相似的肥胖表型（圖1，A至F）。此外，來自C57BL/6J母體的雌性和雄性GF後代在餵食HFD時均出現嚴重的肥胖和代謝紊亂。因此，在或多或少的程度上，研究者可以普遍觀察到GF後代的代謝紊亂與小鼠譜系和性別無關。
檢測胚胎中的母體短鏈脂肪酸（SCFAs）
研究者在本實驗動物設施條件下無法於懷孕的SPF ICR小鼠羊水中檢測到細菌。研究者假設源自母體腸道菌群的代謝信號可能會轉移到胎兒體內並影響其代謝系統的發育。因此，研究者分析了SPF和GF ICR母體及其胚胎在懷孕期間的親水性和親脂性代謝物的血漿水平。在SPF和GF組之間，母體中5種代謝物的水平顯著不同，而胚胎中有12種代謝物；其中，在母體和胚胎中只有5種代謝物在響應飼養條件時表現出相似的變化（圖2A）。比較特別的是，GF母體和胚胎中SCFAs（醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽）的血漿水平明顯低於SPF中對應物的血漿水平（圖2B）。考慮到懷孕期間SPF組中母體和胚胎內SCFAs血漿水平都是恆定的，那麼母體腸道菌群似乎可以通過血液向胚胎提供SCFAs。
圖2. 胚胎的SCFAs依賴於母體腸道菌群，而其受體已在胚胎期表達。（A）火山圖顯示了母體中或來自ICR SPF和GF母體的胚胎中血漿代謝產物相對丰度差異的顯著性和重要性（每組母體的血漿樣品n = 5；每組胚胎的血漿樣品n = 5）。（B）通過氣相色譜-質譜法（GC-MS）鑑定血漿SCFAs的水平（每組母體（Mo）的血漿樣品n=8，每組胚胎的血漿樣品n=8）。（C）頸上神經節生長期間G蛋白偶聯受體41（Gpr41）、酪氨酸羥化酶（Th）、巢蛋白（Nes）、膠質原纖維酸性蛋白（Gfap）的表達（每組中n=8）。（D）生長過程中結腸Gpr41、Gpr43、Gcg、Pax4和Pax6的表達（每組中n=7或8）。（E）生長過程中胰腺Gpr41、Gpr43、Ins2和Nkx6.1的表達（每組中n=7或8）。（C）圖到（E）圖中相對於18S rRNA基因的表達來表示數值。（B）圖中進行Student’s t檢驗，**P<0.01>
已有研究報道腸道微生物的SCFAs通過激活GPR41和GPR43來調節宿主的能量代謝。研究者在胚胎的交感神經節（圖2C）中檢測到了Gpr41 mRNA，並且其在胚胎期和成年期呈雙相表達（圖2C）。這種表達模式在巢蛋白（Nes；一種未分化的神經標誌物）、酪氨酸羥化酶（Th；一種交感神經元的標誌物）或膠質原纖維酸性蛋白（Gfap；一種神經膠質標誌物）中並未觀察到（圖2C）。同時，從胚胎第15.5天（E15.5）開始在腸道中檢測到Gpr43mRNA，儘管在先前的報道中，它的表達僅限於成年期的腸內分泌細胞中。在胚胎期和成年期的結腸內都觀察到Gpr43表達的雙相增加，其表達高峰期晚於Pax4和Pax6（腸道內分泌細胞分化的調節劑），並且其與Gcg（腸道內分泌細胞的生產者，GLP-1）在相似的時間點出現（圖2D）。這些SCFAs受體也在胰腺中表達，並調節成年小鼠的胰島素分泌。在圍產期和產後期之間，胰腺的Gpr43 mRNA（而非Gpr41）會出現瞬時升高，其表達峰值晚於Nkx6.1（早期β細胞分化的相關因子），並與Ins2（胰腺β細胞的生產者）在相似的時間點表達（圖2E）。值得注意的是，儘管GF和SPF這兩組的胚胎交感神經節中的Gpr41 mRNA表達相似，但GF胚胎內結腸和胰腺中的Gpr43 mRNA的表達水平均顯著低於SPF胚胎內的情況。這些發現表明，胚胎的代謝組織，比如交感神經系統、腸道和胰腺，可能通過表達GPR41和GPR43來感知母體腸道微生物衍生的SCFAs。
通過GPR41促進交感神經系的發育
研究者進一步調查了GPR41在交感神經系統中的功能以及GPR43在胚胎髮育期間腸道和胰腺中的功能。研究者發現與野生型（WT）的胚胎相比，Gpr41-/-C57BL/6J胚胎中交感神經投射到心臟的現象明顯減少，並且這種異常現象在具有相同背景的GF胚胎中也很明顯（圖3A）。而且，在出生後1天（P1）的Gpr41-/-幼崽中交感神經投射到心臟的現象也明顯減少了，即使這些幼崽是被SPF條件下飼餵的母體分娩出來的（圖3B）。對於WT小鼠、Gpr41-/-小鼠和Gpr43-/-懷孕的C57BL/6J小鼠，它們的腸道微生物組成相似。血漿的SCFAs水平在三組之間也基本相當。
圖3. 丙酸鹽通過胚胎GPR41促進交感神經元的分化。（A）E18.5時整個心臟中TH的表達（每組中n=7或8）和具有代表性的Western印跡。（B）交感神經投射到P1整個心臟（上圖）（TH免疫染色）以及心室（下圖）（TH，綠色；DAPI，藍色）。TH密度的定量（每組中n=9或10）。（C）丙酸鹽（1mM）對Gpr41-/-小鼠中交感神經元分化的影響（TH：紅色；DAPI：藍色；每種條件下進行三個生物學重複，且每個獨立實驗中n=10）。（D）通過Western印跡來定量P1心室內神經元投射的發育（每組中n=8或11）以及代表性的Western印跡。Abx：抗生素處理。（E）4周齡後代的心率（左）（每組中n=7~11）和體溫（右）（每組中n=8）。（F）4周齡後代的能量消耗（每組中n=8）。Student’s t檢驗（圖（A）和圖（B））以及Tukey–Kramer’s檢驗（圖（C）~圖（F））；**P<0.01>
研究者進一步試圖探討GPR41信號傳導對交感神經元分化的貢獻。在胚胎頸上神經節（SCG）-衍生的神經細胞的原始培養中，每個檢測的SCFAs（尤其是丙酸鹽）都顯著促進交感神經元的分化。這一發現與以下觀點一致：GPR41最有效的興奮劑是丙酸鹽，其次是丁酸鹽和乙酸鹽，它們的有效中濃度（EC50）值分別約為10、40和2000 μM。丙酸鹽誘導的交感神經元分化在來自Gpr41-/-小鼠胚胎的交感神經元細胞中被消除（圖3C）。此外，Gi/o-介導（而不是Gi/oα-介導）的GPR41丙酸鹽信號通過Gβγ-介導絲裂原活化蛋白激酶的活化從而增加交感神經突的長度。這些發現充分表明丙酸鹽介導的GPR41活化促進了交感神經元的分化。為了驗證這一觀點，研究者使用抗生素混合物處理了WT懷孕的小鼠，以清除其腸道菌群。在P1時期經抗生素處理的小鼠幼崽中交感神經對心臟的投射明顯減弱了。值得注意的是，懷孕期間服用丙酸鹽可改善這種異常（圖3D）。斷奶後的心律和體溫是交感神經投射的指標，其與耗氧量展現出相似的趨勢（圖3，E和F）。酪胺處理顯著降低了來自未處理、丙酸鹽處理或抗生素處理等WT母體的後代耗氧量，而這些影響在來自抗生素處理的WT母體或未處理的Gpr41-/-母體的後代中減弱了（圖3F）。基於這些觀察，研究者認為來自母體腸道菌群的丙酸鹽可以通過GPR41促進交感神經的發育。丙酸鹽的缺乏導致交感神經的功能障礙，包括體溫降低和心率波動，這與在GF後代中觀察到的現象相似（圖1C）。
通過GPR43進行胚胎胰島素的調節
GPR43在成人的腸內分泌L細胞中表達，並在激活後促進腸道激素的分泌。因為在胚胎結腸中也檢測到了Gpr43，所以研究者調查了GPR43在胚胎期對腸內分泌細胞分化的影響。與WT胚胎相比，Pax4和Pax6在Gpr43-/-C57BL/6J胚胎的結腸中出現明顯上調（圖4A）。此類變化在具有相同遺傳背景的GF胚胎中也觀察到了。相比之下，Gcg和GLP-1在Gpr43-/-和GF小鼠中被下調（圖4A）。該結果表明在Gpr43-/-和GF小鼠中腸內分泌細胞的分化出現了延遲。為了直接評估SCFA-GPR43軸在腸內分泌細胞分化中的作用，研究者利用了腸道類器官，其通過減少典型的Wnt信號傳導概括了體內的細胞分化。丙酸鹽（EC50：~ 30 μM）是一種比乙酸鹽或丁酸鹽（EC50：分別為~50或100 μM）更有效的GPR43配體，其可以顯著促進來自WT胚胎的腸道類器官內GLP-1 +腸內分泌細胞的分化（圖4，B和C）。與之形成鮮明對比的是，這種作用在Gpr43-/-胚胎的類器官中消失了（圖4，B和C）。值得注意的是，丙酸鹽對腸內分泌細胞分化的影響在成年WT小鼠的類器官中並未觀察到，說明丙酸鹽介導的GPR43信號傳導是產前期腸內分泌細胞發育的先決條件。
圖4. 丙酸鹽通過胚胎GPR43促進腸內分泌細胞和胰腺β細胞的分化。（A）結腸（E18.5）中Pax4、Pax6和GcgmRNA的表達和GLP-1蛋白的水平（每組中n=7或8）。（B和C）在Wnt存在（+）或不存在（-）及GPR43配體（圖（B）：1mM和10mM的丙酸鹽；圖（C）：100μM的丙酸鹽）對胚胎類器官（E15.5）處理24h後的Gcg表達（B）和GLP-1-陽性細胞的分佈（C）。GLP-1：綠色；DAPI：藍色；每個條件下進行兩個生物學重複，且獨立實驗中n=5~7。（D）小鼠胰腺（E18.5）中Nkx6.1和Ins2mRNA的表達以及胰島素蛋白水平（每組中n=7或8）。（E）在GPR43配體（10μM PA-1H，1mM丙酸鹽）存在或不存在情況下處理72小時後的Ins2的表達（左）、胰島素的定位（中；免疫染色）以及胰島素陽性細胞的數目（右）（胰島素：綠色；DAPI：藍色；每個條件下進行兩次或三次生物學重複，且獨立實驗中n=4~10）。為了誘導β細胞分化，將細胞與乙胞素和激活素A進行共培養。（F）母體和E18.5胚胎中血漿胰島素水平（左）和血漿葡萄糖水平（右）（每組母體的血漿樣本n=8，胚胎血漿樣本n=8）。圖（A），（D）和（F）中分析的GF和SPF小鼠具有C57BL/6J遺傳背景。Student’s t檢驗（圖（A）,（D）和（F））以及Tukey–Kramer’s檢驗（圖（B）和（F））；**P<0.01>
因為GPR43調節胰腺β細胞中胰島素的分泌，且該受體在圍產期-產後期這個期間的胰腺中表達（圖2E），所以研究者隨後調查了GPR43在胚胎髮育過程中對β細胞分化的影響。與WT和SPF小鼠中的情況相比，分別來自Gpr43-/-和GF小鼠的胚胎胰腺中Nkx6.1均顯著上調，而Gpr43-/-和GF小鼠內Ins2的表達和胰島素水平均下調（圖4D）。此外，在誘導鼠胰腺腫瘤細胞系AR42J分化為β細胞的過程中，Gpr43mRNA的表達水平與Ins2 mRNA的一致，都顯著提高，而Gpr41 mRNA的表達水平卻沒有提高。值得注意的是，丙酸鹽和合成的GPR43興奮劑苯乙酰胺-1（PA-1）促進了向胰島素+β細胞的分化。然而，這種作用被RNA干擾介導的Gpr43敲除削弱了（圖4E）。因此，丙酸鹽介導的GPR43激活促進了胰腺β細胞和GLP-1陽性腸內分泌細胞的分化。GF ICR和GF C57BL/6J的胚胎在交感神經元、腸內分泌細胞和胰腺β細胞的分化和功能標記中也表現出異常。
這些發現增加了這個可能性，即SCFA-GPR43信號傳導在胚胎胰島素分泌的過程中可能起重要作用。儘管WT和Gpr43-/-母體之間沒有差異，但Gpr43-/-胚胎中的血漿胰島素水平明顯低於WT胚胎內的情況（圖4F）。同樣，在GF胚胎中也觀察到了胰島素水平的降低。相應地，Gpr43-/-（圖4F）和GF胚胎中的血漿葡萄糖水平要顯著高於其對照組的水平。鑑於胎兒葡萄糖水平的失調使後代易患代謝綜合徵（例如肥胖症和Ⅱ型糖尿病），研究者推測產前期SCFA-GPR43信號傳導的缺乏會導致成年期的代謝綜合徵，其很可能是通過損害胚胎的能量穩態來實現。在Gpr41-/- Gpr43-/-雙突變C57BL/6J小鼠中，這種交感神經、腸道和胰腺等分化的阻滯現象也很明顯。
懷孕期間膳食纖維的攝入
為了提供SCFAs在肥胖抗性形成起因中重要性的進一步證據，研究者進行了一項飲食干預研究，即在常規條件下給懷孕的ICR小鼠飼餵高纖維（HFi）或低纖維（LFi）的食物，隨後檢測其後代對肥胖的敏感性（圖5A）。儘管來自飼餵HFi母體的後代（HFi後代）產後體重明顯高於飼餵LFi母體後代（LFi後代）的產後體重，但HFi的攝入抑制了從13周齡以後HFD引起的體重增加，這與皮下WAT和肝臟重量的減少現象一致（圖5A）。然而，當對懷孕小鼠施用抗生素以除去腸道菌群時，HFi飲食的作用消失了（圖5A），這表明膳食纖維的微生物發酵有助於抑制肥胖。與LFi後代相比，HFi後代中的血漿代謝參數也得到了改善。同樣，HFi後代對HFD引起的葡萄糖不耐症和胰島素耐受性具有抵抗力，這與能量消耗的改善有關。此外，LFi後代中出現的交感神經功能障礙現象（比如體溫降低和心率波動）在HFi後代中都得到了改善（圖5C）。成年期LFi後代和HFi後代的腸道菌群組成類似，但嬰兒期兩組之間的腸道菌群組成卻存在顯著差異。研究者對母體和胚胎血漿樣品的代謝組分析顯示：在LFi-和HFi-飼餵組之間分別有11和4種代謝物發生了顯著變化，而在HFi-飼餵的母體及其胚胎中有4種代謝物通常增加（圖5D）。在這4種代謝物中，SCFAs是在SPF與GF和LFi與HFi的比較中唯一的共同因素。HFi-飼餵小鼠的胚胎（HFi胚胎）中SCFA的水平顯著高於LFi-飼餵小鼠的胚胎（LFi胚胎）內的情況（圖5E）。研究者還觀察到，HFi胚胎中的血漿胰島素水平顯著高於LFi胚胎的水平（圖5F），從而HFi胚胎中的血漿葡萄糖水平出現顯著降低（圖5F）。因此，母體腸道菌群通過膳食纖維發酵產生的SCFAs通過母體循環提供給胚胎，從而改善胎兒的葡萄糖穩態，並賦予後代抵抗肥胖的能力。
圖5.懷孕母體的膳食纖維補充會導致後代對肥胖產生抵抗力。（A）實驗方案（左）。HFD試驗中的體重變化（中；每組中n=8~13）。組織的重量（右；每組中n=8~13）。（B）血漿葡萄糖、TGs、NEFAs以及總膽固醇的水平（每組中n=8~10）。（C）體溫（左；每組中n=7或8）和心率（右；每組中n=8或10）。（D）火山圖顯示母體中及來自LFi和HFi母體的胚胎中血漿代謝物相對丰度差異的重要性和意義（每組中母體血漿樣本n=5，胚胎血漿樣本n=5）。1：半乳糖。（E）通過GC-MS鑑定血漿SCFAs（每組中母體血漿樣本n=8，胚胎血漿樣本n=8）。（F）母體及E18.5胚胎中的血漿胰島素水平（左）和血漿葡萄糖水平（右）（每組中母體血漿樣本n=8，胚胎血漿樣本n=8）。圖（A）~（C）中在雄性小鼠16周齡時對其進行分析。Student’s t檢驗（圖（B）,（C），（E）和（F））以及Tukey–Kramer’s檢驗（圖（A））；HFi與LFi時，**P<0.01>
懷孕期間SCFA的補充
HFi胚胎中血漿丙酸鹽的水平可能足以激活GPR41和/或GPR43受體，鑑於血漿丙酸鹽的檢測值優於EC50值（圖5E）。正子斷層掃描（PET）成像顯示，結腸腔內[11C]-標記的丙酸鹽在輸入40分鐘內通過母體的肝臟和血流到達胚胎。因此，為了嚴格檢驗丙酸鹽在後代擁有肥胖抗性中的作用，研究者給懷孕ICR小鼠飼餵補充了丙酸鹽的LFi食物（圖6A）。這種食物的攝入會提高母體和胚胎內血漿的丙酸鹽水平。丙酸鹽的補充處理抑制了HFD引起的成年後代的體重、腎周或皮下WAT數量以及肝臟重量的增加（圖6A）。與對照組的LFi後代相比，丙酸鹽處理後的母體後代（Pro後代）的血漿代謝參數也得到了改善（圖6B）。在Pro後代中，HFD引起的葡萄糖不耐症和胰島素抗性得到了明顯改善，且其能量消耗也改善了。此外，Pro後代恢復了LFi後代中出現的交感神經功能障礙現象（圖6C）。在嬰兒期和成年期中，LFi後代和Pro後代之間的腸道菌群組成相似。此外，母體的丙酸鹽干預措施逆轉了飼餵LFi的母體胚胎中交感神經向心髒的投射阻滯以及GLP-1 +腸內分泌細胞和胰腺β細胞的分化延遲（圖6，D和E）；它也提高了胚胎中血漿胰島素的水平，使其恢復到與HFi胚胎內相當的水平（圖6F）。因此，補充丙酸鹽母體的胚胎中有效抑制了對照組胚胎的血漿葡萄糖水平增加的現象（圖6F）。與接受抗生素處理且飼餵HFi的母體後代情況一致，飼餵HFi的GF ICR母體的後代重現了易肥胖表型，該表型在懷孕期間通過施用丙酸鹽來避免。這些發現共同定義了母體丙酸鹽的重要性，其使後代對肥胖具有抵抗力。
圖6.懷孕母體的丙酸鹽補充會導致後代對肥胖產生抵抗力。（A）實驗方案（左）。HFD試驗中的體重變化（中；每組中n=11~13）。組織的重量（右；每組中n=11~13）。（B）血漿葡萄糖、TGs、NEFAs以及總膽固醇的水平（每組中n=8~13）。（C）體溫（左；每組中n=6或8）和心率（右；每組中n=6或9）。（D）E18.5時整個心臟中TH的表達（每組中n=8）和代表性的Western印跡。（E）結腸（E18.5）中Gcg mRNA的表達以及GLP-1蛋白水平（左；每組中n=8）。胰腺（E18.5）中Ins2 mRNA的表達以及胰島素蛋白水平（右；每組中n=8）。（F）E18.5時母體和胚胎的血漿胰島素水平（左；每組中母體血漿樣本n=8，胚胎血漿樣本n=8）和血漿葡萄糖水平（右；每組中母體血漿樣本n=8，胚胎血漿樣本n=8）。圖（A）~（C）中在小鼠16周齡時對雄性小鼠進行分析。Student’s t檢驗（圖（A）~（F））; **P<0.01>
討論
在這項研究中，作者認為懷孕期間母體的腸道菌群可通過SCFA-GPR41和SCFA-GPR43軸賦予後代對抵抗肥胖的能力。懷孕期間，胚胎的交感神經、腸道和胰腺中的GPR41和GPR43可以感知到來自母體腸道菌群的SCFAs。已知SCFAs通過多種機制能夠發揮多效作用，比如丁酸鹽對組蛋白去乙酰基酶（HDAC）的抑制作用（半抑制濃度（IC50）：~90至170μM）、丁酸鹽對GPR109A的激活（EC50：~700μM）、乙酸鹽（EC50：~2300μM）和丙酸鹽（EC50：~1000 μM）對Olfr78（嗅覺感受器）的激活。考慮到胚胎循環的血漿中SCFAs的濃度較低（乙酸鹽：~400μM；丙酸鹽：~50μM和丁酸鹽：~10μM），SCFAs不太可能與Olfr78和GPR109A互作。同時，SCFAs的濃度足以激活GPR41和GPR43。SCFAs對胚胎GPR41和GPR43的激活促進了交感神經元、腸內分泌細胞和胰腺β細胞的分化，這對於通過交感神經系統和胎兒葡萄糖穩態來維持的能量穩態（例如產熱和心率）至關重要。此外，鑑於在GF後代的胰腺和結腸中Gpr43的表達趨於下調，SCFAs（如丁酸鹽和丙酸鹽，也可作為HDAC的一種抑制劑）可通過表觀遺傳修飾調節Gpr41和Gpr43的基因表達來調節胚胎髮育。
除SCFAs以外的其它幾種代謝物在SCF和GF條件下母體和胚胎的血漿中也表現出相似的變化。但是，與飼餵LFi的母體及其胚胎中的情況相比，在飼餵HFi的母體及其胚胎中通常僅SCFAs提高了。使用丙酸鹽處理LFi飼餵的母體可修復胚胎中腸內分泌細胞和交感神經元的分化缺陷，但是在Gpr41和Gpr43敲除的情況下丙酸鹽的修復作用消失了。這些觀察結果強調了SCFA-GPR41和SCFA-GPR43軸在新陳代謝和神經系統的產前發育中所做出的貢獻。此外，儘管來自GF-ICR和GF-C57BL/6J母體的後代出現了肥胖症，但兩組之間肥胖症表型的嚴重程度稍有不同。這種差異可歸因於腸道微生物的組成，其受宿主遺傳背景的影響很大。與此觀念一致的是，研究者發現ICR和C57BL/6J母體之間的血漿SCFA水平有所不同（圖2B）。
儘管SPF和GF後代在成年期的腸道菌群組成相似，但這兩組的腸道菌群在嬰兒期的組成卻不同。與LFi後代相比，在HFi後代的嬰兒期也觀察到了類似趨勢，這增加了嬰兒期微生物群的改變在一定程度上促進GF和LFi後代肥胖表型發展的可能性。然而，對懷孕的LFi母體施用丙酸鹽可以改善後代易肥胖的表型，且不會影響嬰兒期後代的微生物群。此外，丙酸鹽處理還改善了GF胚胎中的高血糖症，並降低了LFi和GF後代的能量消耗。儘管GPR41缺乏症也會導致較低的能量消耗，但懷孕期間施用丙酸鹽並不能預防該表型。基於這些觀察結果，研究者認為母體微生物衍生的SCFAs（尤其是丙酸鹽）在預防後代代謝失調的發展中起著至關重要的作用。同時，應該注意的是，GF後代在光週期和暗週期中都表現出能量消耗的異常，而LFi後代僅在暗週期中表現出異常的能量消耗。因此，研究者並不能正式地排除這個可能性，即腸道菌群和/或其產物（SCFAs以外）的存在可能有助於增加光週期時的能量消耗。
GF母體胚胎中胰島素的調節受到損害，且成年期胰島素水平顯著升高。成年GF後代中胰島素水平過高很可能歸因於一種代謝適應，即對出生體重低和胰腺β細胞分化延遲的響應，最終增加了HFD飼餵條件下後代對肥胖的敏感性。這種異常使人想起追趕性增長，正如多項出生隊列的研究證明的一樣，小於胎齡（SGA）出生的孩子在以後的生活中面臨著體重過度增加和代謝綜合徵的風險。儘管目前尚不清楚SGA出生的病因，但可能與營養不良、吸菸和飲酒等在內的母體因素有關。研究者進一步提出，腸道微生物群紊亂導致的SCFA缺失可能是SGA出生的另一個致病因素，從而引起追趕性增長和肥胖症易感性。本研究提供了證據，證明孕期母體腸道環境對預防後代出現代謝綜合徵的代謝程序至關重要。這一發現為通過靶向母體腸道菌群從而搶先治療代謝性疾病開闢了新的研究途徑。
