來源：探癌
1、我們先來了解概念，什麼是液體活檢？
液體活檢是採用包括血液、尿液、唾液、胸水、腹水、腦脊液等在內的人體體液，作為檢測樣本的一類非入侵性的檢測方法。
2、為什麼癌症領域要做液體活檢呢？
液體活檢作為一種新興的癌症檢測技術，能夠非侵入性地反映體內腫瘤狀態，並可應用於腫瘤的早期篩查和診斷、轉移和進展、耐藥性、預後評估、監測復發、微小殘留病灶檢測、腫瘤的異質性進化以及建立基因表達譜等領域，其在這些領域擁有技術優勢和廣泛的臨床應用價值。根據腫瘤相關物質的類型，液體活檢涵蓋了循環腫瘤細胞(CTCs)、循環腫瘤DNA(ctDNA)、細胞外囊泡(EVs)和循環腫瘤RNA(ctRNA)等檢測靶標。
現階段，液體活檢關聯的市場增長非常快。全球液體活檢市場從2018年的12.44億美元增長到2025年的約120.62億美元，2019年至2025年間的複合年增長率達38.3％【1】。這一市場包括CTC、ctDNA和外泌體應用的硬件(包括系統和設備)和試劑盒銷售，以及服務收入。目前，液體活檢分析物還是主要集中在 ctDNA 和 CTC 的捕獲和分析上。整個市場的產業化發展也很迅速，目前已有多項液體活檢產品獲准進入臨床，更有許多轉化研究在蓬勃開展。儘管液體活檢技術的臨床應用仍然面臨著諸多挑戰，標準化與質量管理體系還有待完善，但是液體活檢作為應用前景廣闊的檢測新技術，將成為臨床迫切需求並值得信賴的診斷工具，特別是在已上升到了國家戰略高度的癌症早診領域的應用。癌症的早期診斷目的是為了減少在晚期被診斷出的患者的比例，在儘可能早的階段提供護理來改善癌症結果（圖1）。
圖1 各癌種中早期診斷和晚期診斷的5年生存率比較
早在2016年，在The Lancet Oncology雜誌在發表了一篇述評《癌症液體活檢：癌症檢測的未來？》【2】，在這篇述評中對GRAIL公司的一項計劃——“通過血液篩查及早發現無症狀個體的癌症”（the early detection of cancer in asymptomatic individuals through a blood screen）進行了討論。GRAIL公司的這個計劃旨在創建一種通用的血液檢測方法，從而可以對無症狀個體進行多種類型的癌症篩查。文中提到了ctDNA應用於腫瘤領域的一些難題需要去克服：
(1) 首先，目前還沒有通用型的用於篩查任何疾病階段或癌症類型的ctDNA產品，是因為檢測低濃度的ctDNA很難，突破這一侷限性需要通過更靈敏的技術來克服，但敏感度的提高會導致來自胚系的噪聲增加，這反過來又會使技術人員很難區分腫瘤相關的DNA突變和非腫瘤相關的DNA突變，從而導致檢測結果假陽性的風險增加。
(2) 第二，ctDNA檢測到底會檢測到什麼，這項檢測可以區分什麼？例如，並不是所有的癌症都與早期基因突變有關，而且許多癌症都有可能在任何疾病階段、以不可預測的方式出現的多個基因突變，除非發現一種新的、尚未發現的泛癌標誌物，否則通用型的ctDNA檢測的設計會比較複雜。
(3) 第三，並不是所有的腫瘤都以同樣的方式將ctDNA釋放到血液中。相反，研究表明，ctDNA濃度不僅與腫瘤負荷直接相關，而且與克服血腦屏障或粘液組織等障礙進入血液的難易性有關。
(4) 第四，任何新的診斷檢測都必須經過臨床驗證，這是監管批准的必要步驟，因此，ctDNA檢測在腫瘤領域的應用需要有更多的臨床驗證。
(5) 第五，臨床醫生等如何處理泛癌檢測結果的有關信息也是一個問題，因為早期檢測是為了降低與癌症相關的死亡率，然而，在無症狀的未經選擇的人群中進行篩查的價值仍然存在爭議，過度治療仍是一個令人擔憂的問題，過度治療可能會嚴重惡化生活質量，帶來與初心相反的後果。
最近，The Lancet Oncology雜誌發表的一篇述評《癌症檢測：對所有人進行液體活檢的探索》【3】，這篇述評對4年前的述評《癌症液體活檢：癌症檢測的未來？》提到的關於ctDNA在腫瘤早篩早診中幾個問題做出來回應（也就是對上文提到的幾個問題做出了回應）。文章提出，基於在今年發佈的兩項新的研究——CCGA研究和DETECT-A試驗結果能幫助解答我們對ctDNA腫瘤早篩早診應用的一些疑惑。這兩項研究的初步結果也令人鼓舞。我們來看一下這兩項研究公佈的結果情況。
CCGA研究（The Circulating Cell-free Genome Atlas study）【4】
CCGA（NCT02889978）是一項前瞻性、多中心、病例對照和縱向隨訪的觀察性研究。該研究是由Garil公司啟動的循環遊離基因組圖譜研究臨床實驗項目，旨在在無症狀腫瘤患者血液中發現腫瘤DNA，並對腫瘤進行早期篩查和診斷。CCGA研究共分為三個預先設定的子研究（圖2）：① 發掘研究；②用選定的分析來進行進一步分析驗證，以及③進一步驗證。第一個子研究的目的是確定進一步開發的最高性能的檢測方法，因此第一個子研究包括三種獨立的、全面的測序方法。這3種測序方法包括：針對cfDNA和白細胞進行靶向配對測序，以檢測單核苷酸變異、小片段的插入和（或）缺失突變；對cfDNA和白細胞進行WGS（全基因組測序），以檢測拷貝數變異；通過WGBS（全基因組DNA甲基化測序），檢測cfDNA甲基化的異常。研究結果發現WGBS優於靶向測序和WGS。在第二個子研究中，基於第一個子研究的結果，選擇了基於甲基化的分析方法進行進一步開發，該結果目前已經公佈。第三個子研究即將進行。
圖2 Garil公司啟動的CCGA研究的3個子研究
CCGA第二個子研究包括4841名參與者，分為中訓練集（n=3133，1742例癌症和1391例非癌症）和獨立驗證集（n=1354，740例癌症和614例非癌症），以及354個樣本被保留用於腫瘤活檢的參考集。這些參與者涵蓋了超過50種原發癌症類型，以及疾病的所有臨床階段。
該子研究結果在今年ESMO上公佈，研究結果顯示：
① 訓練集和驗證集結果一致；
② 在驗證集中，cfDNA靶向甲基化分析檢出癌症的特異性為99.3%，假陽性率0.7%；
③ 在預先指定的12種癌症類型（肛門、膀胱、結腸/直腸、食道、頭頸、肝/膽管、肺、淋巴瘤、卵巢、胰腺、漿細胞瘤、胃）中，I-III期腫瘤的敏感性為67.3%；在所有癌症類型中的敏感性為43.9%；
④ 隨著腫瘤分期的增加，腫瘤的檢出率增加；在指定的癌症類型中，I期的敏感性為39%，II期為69%，III期為83%，IV期為92%；在所有的癌症類型中，I期的敏感性為18%，II期為43%。III期為81%，IV期為93%；
⑤ 在有癌信號的樣本中，有96%的樣本追溯了其腫瘤組織的起源；腫瘤組織起源的定位準確率達到93%。
cfDNA的靶向甲基化分析可同時檢測和定位50多個癌種，並能夠在所有的疾病階段檢測到腫瘤（I–III階段敏感性為43.9％；I–IV階段敏感性為54.9％），檢出腫瘤的特異性> 99％，假陽性率<1％。
DETECT-A試驗
（Detecting cancers Earlier Through Elective mutation-based blood Collection and Testing）【5】
DETECT-A試驗是一項探索性的前瞻性的干預性研究，以評估包含cfDNA突變和蛋白質生物標誌物的血液檢測應用於腫瘤早篩，並將血液檢查與全身PET-CT相結合。
DETECT-A試驗中，在患者啟動癌症診斷檢查之前包含了三個步驟（圖3）：
（1）首先，評估基線時期的外周血液樣本，在基線時至少有一個生物標誌物的值存在異常的個體會被邀請提供第二份血液樣本；
（2）通過第二份血液樣本以確定基線時期存在異常的標誌物是否持續異常，並嚴格排除由於克隆造血等因素引起的突變，排除其他因素後，如果確認存在生物標誌物的持續異常情況，則認為血液測試呈陽性；然後由來自幾個相關領域的專家組成的多學科審查委員會，對血液檢測呈陽性的個體的病史進行審查，以排除任何引起異常結果的潛在非癌相關原因，如果沒有發現引起標誌物持續異常的非癌原因，這部分參與者則接受第三部分PET-CT測試；
（3）PET-CT成像用於確認血液檢測結果，並以安全和微創的方式定位潛在的癌症。
圖3 DETECT-A試驗時間線
在DETECT-A研究的基線時期，在9911名參與者中，490人（4.9%）血液檢測結果為陽性，在這些測試中，進一步血液檢測確認134人（9911名參與者中的1.35%）血檢為陽性。在這134名血檢陽性的參與者中，127人接受了影像學檢查，其中有64人（50%）是有癌症相關的影像學檢查，而在這64名參與者中，有26名（41%）隨後通過活檢或其他明確的證據被證實患有癌症。這26名血檢呈陽性的癌症患者可以被認為是通過驗血發現的癌症，其中9例為肺癌，6例為卵巢癌和2例為結直腸癌。而且這26例患者中，有17例（65%）是局部性或區域性的腫瘤，其中包括了5例I期腫瘤患者。
研究數據顯示，在血液基線檢測為陽性但沒有經過第二次血檢確認的參與者中，其血檢的特異性為95.3%，而經過2次血檢確認為陽性的特異性為98.9%，血液檢測的陽性預測值（PPV）同時從5.9%增加到19.4%。將血液檢查與全影像學相結合，特異性和PPV進一步增加，分別上升至99.6%和40.6%（圖4）。
圖4 DETECT-A研究中檢測的性能
在DETECT-A試驗中，將血液檢查（cfDNA突變+蛋白標誌物）與影像學（全身PET-CT）相結合進行癌症篩查，其特異性大於99%，在檢測結果為癌症的患者中有65%的癌症處於早期。
從爆發的臨床研究我們不難看出，液體活檢應用於癌症早篩早診離我們越來越近，結合液體活檢方法與當前的篩查手段，可能會大大改善腫瘤的診斷。隨著技術的發展，價格將會成為液體活檢在腫瘤早篩早診領域考量的重要槓桿。從這次COVID-19疫情中，我們獲得的一個明顯教訓是，即使在高收入國家，大規模檢測也可以迅速加劇衛生系統中現有的資金不足。考慮到全球範圍內癌症數量的快速增長，類似問題的考慮對癌症也尤為重要。對於政府、保險公司，甚至是檢測服務公司來說，必須要清晰瞭解通過早期發現和治療癌症而獲得的長期資金節省的理由，以及相應的液體活檢檢測能否具有適用於大規模人群的成本效益。相信技術研發的發展，對所有人都進行癌症液體活檢會成為可能。
參考文獻
【1】Global liquid biopsy market will reach USD 12,062 million by 2025: Zion Market Research [news relsease]. New York, NY; Zion Market Research. May 14, 2019.
【2】Liquid Cancer Biopsy: The Future of Cancer Detection?Lancet Oncol. 2016 Feb;17(2):123. < DOI: 10.1016/S1470-2045(16)00016-4.>
【3】Cancer Detection: The Quest for a Single Liquid Biopsy for All.Lancet Oncol. 2020 Jun;21(6):733.
【4】M.C. Liu, G.R. Oxnard ,E.A. Klein, et al.Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA.Annals of Oncology.VOLUME 31, ISSUE 6, P745-759, JUNE 01, 2020
【5】Anne Marie Lennon , Adam H Buchanan , Isaac Kinde, et al. Feasibility of blood testing combined with PET-CT to screen for cancer and guide intervention.Science. 2020 Apr 28;eabb9601.
